Τα φυτοφάρμακα διαδραματίζουν κρίσιμο ρόλο στην αντιμετώπιση της παγκόσμιας έλλειψης τροφίμων και στην καταπολέμηση των ασθενειών που μεταδίδονται από φορείς. Ωστόσο, το αυξανόμενο πρόβλημα της αντοχής στα φυτοφάρμακα απαιτεί επειγόντως την ανακάλυψη νέων ενώσεων που στοχεύουν σε υποχρησιμοποιημένους στόχους. Τα κανάλια του παροδικού δυναμικού υποδοχέα εντόμων (TRPV) - Nanzhong (Nan) και ανενεργά (Iav) - μπορούν να σχηματίσουν ετερόλογους διαύλους (Nan-Iav) και να εντοπιστούν σε μηχανοαισθητήρια όργανα που μεσολαβούν στον γεωτροπισμό, την ακοή και την ιδιοδεκτικότητα στα έντομα. Ορισμένα φυτοφάρμακα, όπως η αφιδοπυρρολιδόνη (AP), στοχεύουν το Nan-Iav μέσω άγνωστων μηχανισμών. Το AP είναι αποτελεσματικό έναντι των εντόμων που τρυπούν και ρουφούν (ημίπτερα), εμποδίζοντας τη σίτιση διαταράσσοντας τη λειτουργία των νηματίων. Το AP μπορεί να συνδεθεί μόνο με το Nan, αλλά μόνο το Nan-Iav μπορεί να αλληλεπιδράσει με αγωνιστές, συμπεριλαμβανομένης της ενδογενούς νικοτιναμίδης (NAM), επιδεικνύοντας έτσι δραστηριότητα καναλιού. Παρά το δυναμικό του Nan-Iav ως στόχου εντομοκτόνου, λίγα είναι γνωστά για τη συναρμολόγηση των καναλιών του, τις ρυθμιστικές θέσεις σύνδεσης και την εξαρτώμενη από Ca2+ ρύθμιση, εμποδίζοντας την περαιτέρω ανάπτυξη εντομοκτόνων. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήθηκε κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία για τον προσδιορισμό της δομής της Nan-Iav σε έντομα Hemiptera στην κατάσταση χωρίς καλμοδουλίνη-υποκαταστάτη, καθώς και με AP και NAM στο όριο του κυτταροπλασματικού τομέα της επανάληψης αγκυρίνης (ARD). Παραδόξως, διαπιστώσαμε ότι η ίδια η πρωτεΐνη Nan μπορεί να σχηματίσει ένα πενταμερές, το οποίο σταθεροποιείται μέσω αλληλεπιδράσεων ARD που προκαλούνται από AP. Αυτή η μελέτη αποκαλύπτει μοριακές αλληλεπιδράσεις μεταξύ εντομοκτόνων και αγωνιστών και Nan-Iav, υπογραμμίζοντας τη σημασία της ARD στη λειτουργία και τη συναρμολόγηση των καναλιών, και διερευνώντας τον μηχανισμό ρύθμισης του Ca2+.
Στο πλαίσιο της ολοένα και πιο σοβαρής παγκόσμιας κλιματικής αλλαγής, η επιδείνωση της παγκόσμιας επισιτιστικής ασφάλειας αποτελεί μία από τις σημαντικότερες προκλήσεις του 21ου αιώνα, με αλυσιδωτές συνέπειες για την κοινωνία.1,2Η έκθεση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας με τίτλο «Κατάσταση της Επισιτιστικής Ασφάλειας και της Διατροφής στον Κόσμο 2023» (SOFI) εκτιμά ότι περίπου 2,33 δισεκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως υποφέρουν από μέτρια έως σοβαρή επισιτιστική ανασφάλεια, ένα μακροχρόνιο πρόβλημα.3,4Δυστυχώς, εκτιμάται ότι περίπου 20% έως 30% ή και περισσότερο των αποδόσεων των καλλιεργειών χάνονται ετησίως λόγω παρασίτων και παθογόνων μικροοργανισμών, και η υπερθέρμανση του πλανήτη αναμένεται να επιδεινώσει την ανθεκτικότητα των παρασίτων και την ευπάθεια των καλλιεργειών.4,5,6,7,8Η ανάπτυξη φυτοφαρμάκων είναι κρίσιμη όχι μόνο για την προστασία των καλλιεργειών από τα παράσιτα και τη μείωση της εξάπλωσης των παθογόνων που μεταδίδονται μέσω φορέων, αλλά και για την καταπολέμηση ασθενειών που μεταδίδονται μέσω φορέων από τον άνθρωπο, όπως ο δάγκειος πυρετός, η ελονοσία και η νόσος Τσάγκας, οι οποίες είναι ολοένα και πιο ανθεκτικές στα φυτοφάρμακα.5,9,10,11
Μεταξύ των κύριων στόχων των νευροτοξικών εντομοκτόνων, το ετεροτετραμερές κανάλι TRPV Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) αντιπροσωπεύει μια κατηγορία στόχων εντομοκτόνων που ανακαλύφθηκαν μόλις την τελευταία δεκαετία, συμπεριλαμβανομένων εμπορικά διαθέσιμων εντομοκτόνων όπως η ιμιδακλοπρίδη και η πυρακλοστροβίνη.12,13,14Το ημισυνθετικό εντομοκτόνο αφιδοπυρρολιφένη (AP) είναι ένα πρόσφατα αναπτυγμένο και εμπορευματοποιημένο προϊόν του οποίου το κύριο συστατικό είναι το δραστικό εντομοκτόνο Inscalis®, το οποίο δεσμεύει την AP σε υπονανομοριακό επίπεδο δραστικότητας.15Το AP εμφανίζει χαμηλή οξεία τοξικότητα σε επικονιαστές, ωφέλιμα έντομα και άλλους μη στοχευόμενους οργανισμούς και, όταν χρησιμοποιείται σύμφωνα με τις οδηγίες της ετικέτας, μπορεί να μειώσει την αντίσταση σε άλλα εντομοκτόνα.16,17,18Οι Nan και Iav κατανέμονται ευρέως σε όλα τα είδη εντόμων, συνεκφράζονται μόνο σε νευρώνες υποδοχέων τάνυσης χορδών των κεραιών και των άκρων και είναι κρίσιμες για την ακοή, την αντίληψη της βαρύτητας και την ιδιοδεκτικότητα.13,16,19,20,21,22Η αντιπυρετική φαρμακευτική ουσία (AP), η ιμιδακλοπρίδη και η πυρακλοστροβίνη διεγείρουν το σύμπλεγμα Nan-Iav μέσω ενός μοναδικού μηχανισμού, αναστέλλοντας τελικά την ιδιοδεκτική μεταγωγή σήματος.13,16,23Στα έντομα που τρυπούν και μυρίζουν (ημίπτερα) όπως οι αφίδες και οι αλευρώδεις μύγες, η απώλεια της ιδιοδεκτικότητας επηρεάζει αρνητικά την ικανότητα σίτισής τους, οδηγώντας τελικά σε θάνατο.13,24Είναι ενδιαφέρον ότι το AP εμφανίζει υψηλή συγγένεια για το σύμπλοκο Nan-Iav και χαμηλή συγγένεια για το Nan μόνο του. Η σύνδεση του AP με το Nan-Iav προκαλεί ηλεκτρικό ρεύμα, αλλά η σύνδεση με το Nan μόνο του δεν διεγείρει τη δραστηριότητα του καναλιού. Το ίδιο το Iav δεν συνδέεται καθόλου με το AP.16Αυτό υποδηλώνει ότι η Nan και η Iav μπορούν να συνδεθούν σχηματίζοντας διαφορετικά σύμπλοκα καναλιών Nan-Iav (π.χ., με διαφορετικές στοιχειομετρικές αναλογίες ή διαφορετικές διατάξεις εντός της ίδιας στοιχειομετρικής αναλογίας) ή ότι η AP μπορεί να συνδεθεί σε πολλαπλές θέσεις. Επιπλέον, η φυσική αγωνιστής νικοτιναμίδη (NAM) συνδέεται με την Drosophila Nan-Iav με μικρομοριακή συγγένεια, παρουσιάζοντας επιδράσεις παρόμοιες με εκείνες των αφίδων (AP) in vitro.16,25και αναστέλλοντας την αναπαραγωγή και τη διατροφή των αφίδων, οδηγώντας τελικά στον θάνατό τους25,26Αυτά τα δεδομένα εγείρουν πολλά ερωτήματα. Για παράδειγμα, παραμένει ασαφές πώς σχηματίζεται το ετεροδιμερές Nan-Iav, ποιες θέσεις σύνδεσης χρησιμοποιούνται για τη ρύθμιση μικρών μορίων και πώς αυτά τα μικρά μόρια ρυθμίζουν τη λειτουργία του καναλιού καταστέλλοντας την ιδιοδεκτικότητα. Επιπλέον, οι λόγοι για τους οποίους το ίδιο το Nan είναι ανενεργό και έχει χαμηλή συγγένεια για το AP, ενώ το ετεροδιμερές Nan-Iav είναι ενεργό και συνδέεται με το AP με υψηλότερη συγγένεια, παραμένουν ασαφείς. Τέλος, λίγα είναι γνωστά για την εξαρτώμενη από Ca2+ ρύθμιση της λειτουργίας του Nan-Iav και πώς ενσωματώνεται στις νευρωνικές σηματοδοτικές διεργασίες.. 13,21
Σε αυτή τη μελέτη, συνδυάζοντας κρυοηλεκτρονική μικροσκοπία, ηλεκτροφυσιολογία και τεχνικές σύνδεσης ραδιοσυνδετών, διευκρινίσαμε τη συναρμολόγηση του Nan-Iav και τον μηχανισμό σύνδεσής του με ρυθμιστές μικρών μορίων. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε σταθερά συνδεδεμένη καλμοδουλίνη (CaM) με Iav και σταθεροποιημένα με AP πενταμερή Nan. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για τη ρύθμιση των ιόντων ασβεστίου σε κανάλια, τη συναρμολόγηση καναλιών και τους παράγοντες που καθορίζουν τη συγγένεια σύνδεσης του συνδετήρα. Το πιο σημαντικό, επιβεβαιώσαμε ότι το ARD παίζει κεντρικό ρόλο σε αυτές τις διεργασίες. Η μελέτη μας για πλήρη κανάλια εντόμων συνδεδεμένα με σχετικά γεωργικά φυτοφάρμακα27, 28, 29ανοίγει προοπτικές για την ανάπτυξη της βιομηχανίας φυτοφαρμάκων, βελτιώνοντας την αποτελεσματικότητα και την εξειδίκευση των φυτοφαρμάκων και επιτρέποντας την εφαρμογή ενώσεων που στοχεύουν στο TRPV σε άλλα είδη για την αντιμετώπιση της παγκόσμιας επισιτιστικής ασφάλειας και της εξάπλωσης ασθενειών που μεταδίδονται μέσω φορέων.
Διαπιστώσαμε επίσης ότι το Nan-Iav ρυθμίζεται από το Ca2+ και ο μηχανισμός ρύθμισης προκαλείται από το συστατικό συνδεδεμένο CaM. Είναι σημαντικό ότι αυτή η εξαρτώμενη από Ca2+ ρύθμιση του Nav από το CaM διαφέρει σημαντικά από τους μηχανισμούς ρύθμισης άλλων ιοντικών διαύλων (π.χ., κανάλια Na+ που ελέγχονται από τάση και κανάλια TRPV5/6)52,53,54,55,56,57Στο κανάλι Nav1.2, η C-τελική περιοχή του CaM συνδέεται ελικοειδώς με την C-τελική περιοχή (CTD) και το Ca2+ προκαλεί σύνδεση της Ν-τελικής περιοχής του στο περιφερικό τμήμα της CTD.56Στο κανάλι TRPV5/6, η C-τελική περιοχή του CaM συνδέεται με την CTH και το Ca2+ προκαλεί ανοδική επέκταση της Ν-τελικής περιοχής του στον πόρο, εμποδίζοντας έτσι τη διαπερατότητα των κατιόντων.53,54Προτείνουμε ένα μοντέλο για τη λειτουργία του Nan-Iav-CaM που ρυθμίζεται από Ca2+ (Εικ. 4h). Σε αυτό το μοντέλο, ο Ν-τελικός τομέας του CaM συνδέεται συστατικά με τον C-τελικό τομέα (CTH) του Iav. Στην κατάσταση ηρεμίας (χαμηλή συγκέντρωση [Ca2+]), ο C-τελικός τομέας του CaM αλληλεπιδρά με το Nan, σταθεροποιώντας τη διαμόρφωση του ARD και προάγοντας έτσι το άνοιγμα του καναλιού. Η σύνδεση ενός αγωνιστή/εντομοκτόνου στο κανάλι προκαλεί άνοιγμα πόρων, οδηγώντας σε εισροή Ca2+. Το Ca2+ στη συνέχεια συνδέεται με το CaM, προκαλώντας αποσύνδεση του C-τελικού τομέα από το ARD του Nan. Επειδή η παρεμπόδιση της σύνδεσης CaM ουσιαστικά καταργεί την ανασταλτική δράση του Ca2+, αυτή η αποσύνδεση ρυθμίζει την κινητικότητα του ARD, προκαλώντας έτσι αναστολή ή απευαισθητοποίηση που εξαρτάται από το Ca2+. Η ταχεία ανάκτηση των ρευμάτων καναλιού μετά την έκλουση ιόντων ασβεστίου (Εικ. 4g) υποδηλώνει ότι αυτός ο μηχανισμός διευκολύνει τις ταχείες αποκρίσεις σε νευρωνικά σήματα που προκαλούνται από Ca2+. Επιπλέον, έχει αναφερθεί ότι η C-τελική περιοχή του Iav, η οποία παραμένει ελάχιστα κατανοητή, παίζει και άλλους ρόλους στη στόχευση καναλιών και στην τρέχουσα ρύθμιση.21
Τέλος, η μελέτη μας παρουσιάζει τη δομή υψηλής ανάλυσης ενός συμπλόκου καναλιού TRP εντομοκτόνου-εντομοκτόνου γεωργικής σημασίας - μια ανακάλυψη που δεν μας ήταν προηγουμένως άγνωστη. Αξίζει να σημειωθεί ότι χαρακτηρίσαμε τη δομή και τη λειτουργία του καναλιού εντόμου σε ανθρώπινα κύτταρα (HEK293S GnTi–) και όχι σε κύτταρα εντόμων. Ενόψει της αυξανόμενης αντοχής στα εντομοκτόνα και της συνεχιζόμενης πίεσης στην επισιτιστική ασφάλεια και τα παθογόνα, η εργασία μας παρέχει σημαντικές πληροφορίες που θα διευκολύνουν την ανάπτυξη νέων εντομοκτόνων προς όφελος της ανθρώπινης υγείας και της παγκόσμιας επισιτιστικής ασφάλειας. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα εντομοκτόνα όπως το AP είναι αποτελεσματικά έναντι ορισμένων παρασίτων όταν χρησιμοποιούνται σύμφωνα με τις οδηγίες της ετικέτας και έχουν χαμηλή οξεία τοξικότητα για τους ωφέλιμους επικονιαστές, αποδεικνύοντας την περιβαλλοντική τους ασφάλεια.13,16Επιπλέον, οι δοκιμές ορισμένων παραγώγων AP σε κουνούπια έχουν δείξει ότι τελικά χάνουν την ικανότητά τους να πετούν. Η κατανόηση του τρόπου με τον οποίο αυτές οι ρυθμιστικές ενώσεις συνδέονται με το Nan-Iav θα διευκολύνει την τροποποίηση υπαρχουσών ενώσεων ή την ανάπτυξη νέων ενώσεων για πιο αποτελεσματική καιακριβήςέλεγχος παρασίτων. Η μελέτη μας καταδεικνύει ότι η διεπαφή Nan-Iav ARD είναι κρίσιμη όχι μόνο για τη ρύθμιση της δράσης ενδογενών ενώσεων, φυτοφαρμάκων και Ca2+-CaM, αλλά και για τη συναρμολόγηση των καναλιών. Προτείνουμε ότι η διακοπή της συναρμολόγησης των ετεροδιμερών με μικρά μόρια μπορεί να είναι μια μοναδική και πολλά υποσχόμενη προσέγγιση για την ανάπτυξη αναστολέων ιοντικών διαύλων.
Από τα οκτώ ορθόλογα γονίδια, επιλέχθηκαν τα πλήρους μήκους γονίδια του καφέ σκαθαριού (Halyomorpha halys) Nanchung και Inactive, τα οποία εμφανίζουν εξαιρετική σταθερότητα σε απορρυπαντικά. Τα συντεθειμένα γονίδια βελτιστοποιήθηκαν ως προς τα κωδικόνια για ανθρώπινη έκφραση και κλωνοποιήθηκαν στον φορέα pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) χρησιμοποιώντας θέσεις περιορισμού XhoI και EcoRI. Αυτό διασφάλισε ότι οι κλώνοι ήταν σε πλαίσιο με τις ετικέτες C-τελικού άκρου GFP-FLAG-10xHis και mCherry-FLAG-10xHis, οι οποίες διασπώνται από την πρωτεάση HRC-3C (PPX), επιτρέποντας ανεξάρτητηέκφρασηΟι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν για την κλωνοποίηση των Nanchung και Inactive στον φορέα pBacMam ήταν οι εξής:
Μικροσκοπικές εικόνες μεμονωμένων σωματιδίων ελήφθησαν σε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο διέλευσης Titan Krios G2 (FEI) εξοπλισμένο με κάμερα K3 και ενεργειακό φίλτρο Gatan BioQuantum. Το μικροσκόπιο λειτουργούσε στα 300 keV, με ενεργειακή ρύθμιση 20 eV, μέγεθος pixel δείγματος 1,08 Å/pixel (ονομαστική μεγέθυνση 81.000x) και κλίση αποεστίασης που κυμαινόταν από -0,8 έως -2,2 μm. Η εγγραφή βίντεο πραγματοποιήθηκε στα 40 καρέ ανά δευτερόλεπτο χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Latitude S (Gatan) με ονομαστικό ρυθμό δόσης 25 e–px−1 s−1, χρόνο έκθεσης 2,4 s και συνολική δόση περίπου 60 e–Å−2.
Η διόρθωση κίνησης που προκαλείται από δέσμη και η στάθμιση δόσης πραγματοποιήθηκαν σε φιλμ χρησιμοποιώντας το MotionCor2 στο RELION 4.061. Η εκτίμηση της παραμέτρου της συνάρτησης μεταφοράς αντίθεσης (CTF) πραγματοποιήθηκε στο cryoSPARC χρησιμοποιώντας τη μέθοδο εκτίμησης CTF που βασίζεται σε έμπλαστρο62. Οι φωτομικρογραφίες με ανάλυση προσαρμογής CTF ≥4 Å εξαιρέθηκαν από την επακόλουθη ανάλυση. Συνήθως, ένα υποσύνολο 500-1000 φωτομικρογραφιών χρησιμοποιήθηκε για την επιλογή σημείων στο cryoSPARC, ακολουθούμενο από αρκετούς γύρους ταξινόμησης 2D μετά το φιλτράρισμα για να ληφθεί μια σαφής εικόνα αναφοράς για την επιλογή σωματιδίων με βάση το πρότυπο. Τα σωματίδια στη συνέχεια εξήχθησαν χρησιμοποιώντας πλαίσια οριοθέτησης 64 pixel και 4-πλάσια ομαδοποίηση. Πραγματοποιήθηκαν αρκετοί γύροι ταξινόμησης 2D για την αφαίρεση ανεπιθύμητων κατηγοριών σωματιδίων. Το αρχικό τρισδιάστατο μοντέλο ανακατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας ανακατασκευή ab initio και βελτιστοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μη ομοιόμορφη βελτιστοποίηση στο cryoSPARC. Η τρισδιάστατη ταξινόμηση πραγματοποιήθηκε στο cryoSPARC ή στο RELION με βάση την ετερογένεια ARD. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική ετερογένεια των τομέων της μεμβράνης. Τα σωματίδια ραφιναρίστηκαν χρησιμοποιώντας τις μεθόδους C1 και C2. Τα σωματίδια με υψηλότερη ανάλυση C2 θεωρήθηκαν συμμετρικά ως προς το C2 και εισήχθησαν στο RELION για Bayesian ραφινάρισμα. Τα σωματίδια στη συνέχεια μεταφέρθηκαν πίσω στο cryoSPARC για τελική μη ομοιόμορφη και τοπική ραφινάρισμα. Η τελική ανάλυση και ο αριθμός των σωματιδίων παρουσιάζονται στον Πίνακα 1.
Κατά την επεξεργασία πενταμερών Nan+AP, διερευνήσαμε διάφορες μεθόδους για τη βελτίωση της ανάλυσης των μεμβρανικών τομέων (ειδικά της περιοχής των πόρων), όπως η αφαίρεση σήματος και η κάλυψη TMD. Ωστόσο, αυτές οι προσπάθειες ήταν ανεπιτυχείς λόγω της δυνητικά ακραίας αταξίας στην περιοχή των πόρων και της συνολικής ετερογένειας της TMD. Η τελική ανάλυση υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας μια μάσκα που δημιουργήθηκε αυτόματα με τη μέθοδο μη ομοιόμορφης επεξεργασίας στο cryoSPARC, στοχεύοντας κυρίως την περιοχή ARD. Αυτό πέτυχε σημαντικά υψηλότερη ανάλυση από αυτή των μεμβρανικών τομέων (ειδικά της περιοχής VSLD).
Αρχικά de novo μοντέλα των μορφών apo των μικροοργανισμών Nanchung και Inactive δημιουργήθηκαν αρχικά χρησιμοποιώντας το Coot63, και μοντέλα των μικροοργανισμών Nan και Iav δημιουργήθηκαν χρησιμοποιώντας το AlphaFold264 για τον εντοπισμό περιοχών χαμηλής εμπιστοσύνης. Η μοντελοποίηση καλμοδουλίνης βασίστηκε σε προσαρμογές άκαμπτου σώματος των μοντέλων σύνδεσης Ca2+ και των μοντέλων χωρίς Ca2+ στις καταχωρίσεις PDB 4JPZ56 και 1CFD65, αντίστοιχα. Τα μοντέλα βελτιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας σφαιρική βελτιστοποίηση για να διασφαλιστεί η σωστή στερεοχημεία και η καλή γεωμετρία. Η φωσφατιδυλοχολίνη, η φωσφατιδυλοαιθανολαμίνη και η φωσφατιδυλοσερίνη στη συνέχεια μοντελοποιήθηκαν ως σαφώς καθορισμένες πυκνότητες λιπιδίων και οι υποκαταστάτες NAM και AP τοποθετήθηκαν στις αντίστοιχες πυκνότητες στις σφιχτές συνδέσεις. Αρχεία περιορισμών δημιουργήθηκαν από τη συμβολοσειρά SMILES των ισομορφών χρησιμοποιώντας το eLOW στο PHENIX66. Τέλος, τα μοντέλα βελτιστοποιήθηκαν σε πραγματικό χώρο στο PHENIX χρησιμοποιώντας τοπική αναζήτηση πλέγματος και καθολική ελαχιστοποίηση με περιορισμούς δευτεροταγούς δομής. Ο διακομιστής MolProbity χρησιμοποιήθηκε για τη βελτίωση του μοντέλου και τη δομική ανάλυση, και οι απεικονίσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας PyMOL και UCSF Chimera X. 67,68,69 Η ανάλυση διαφράγματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή HOLE,70 και η χαρτογράφηση διατήρησης αλληλουχίας πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τον διακομιστή Consurf.71
Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τα Igor Pro 6.2, Excel Office 365 και GraphPad Prism 7.0. Όλα τα ποσοτικά δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπικό σφάλμα (SEM). Για τη σύγκριση δύο ομάδων χρησιμοποιήθηκε το t-test του Student (αμφίπλευρο, μη ζευγαρωμένο). Για τη σύγκριση πολλαπλών ομάδων χρησιμοποιήθηκε η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) ακολουθούμενη από το post hoc test του Dunnett. *P< 0,05, **P< 0,01, και ***P< 0,001 θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικά ανάλογα με την κατανομή των δεδομένων. Οι τιμές Kd, Ki και τα ασύμμετρα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism 10.
Για περισσότερες λεπτομέρειες σχετικά με τη μεθοδολογία της μελέτης, ανατρέξτε στην Σύνοψη της Έκθεσης Χαρτοφυλακίου Φύσης που συνδέεται σε αυτό το άρθρο.
Το αρχικό μοντέλο κατασκευάστηκε χρησιμοποιώντας τα μοντέλα καλμοδουλίνης από τις βάσεις δεδομένων PDB 4JPZ και 1CFD. Οι συντεταγμένες έχουν κατατεθεί στην Τράπεζα Δεδομένων Πρωτεΐνης (PDB) με τους αριθμούς πρόσβασης 9NVN (Nan-Iav-CaM χωρίς υποκαταστάτη), 9NVO (Nan-Iav-CaM συνδεδεμένο με νικοτιναμίδιο), 9NVP (Nan-Iav-CaM συνδεδεμένο με νικοτιναμίδιο και EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM συνδεδεμένο με αφενιδολπυρρολίνη και ασβέστιο), 9NVR (Nan-Iav-CaM συνδεδεμένο με αφενιδολπυρρολίνη και EDTA) και 9NVS (Nan πενταμερές συνδεδεμένο με αφενιδολπυρρολίνη). Οι αντίστοιχες εικόνες κρυοηλεκτρονικής μικροσκοπίας έχουν κατατεθεί στη Βάση Δεδομένων Ηλεκτρονικής Μικροσκοπίας (EMDB) με τους ακόλουθους αριθμούς πρόσβασης: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM χωρίς υποκαταστάτη), EMD-49845 (Σύμπλοκο Nan-Iav-CaM με νικοτιναμίδιο), EMD-49846 (Σύμπλοκο Nan-Iav-CaM με νικοτιναμίδιο και EDTA), EMD-49847 (Σύμπλοκο Nan-Iav-CaM με αφιδοπυρρολίνη και ασβέστιο), EMD-49848 (Σύμπλοκο Nan-Iav-CaM με αφιδοπυρρολίνη και EDTA) και EMD-49849 (Σύμπλοκο Nan πενταμερούς με αφιδοπυρρολίνη). Τα ακατέργαστα δεδομένα για τη λειτουργική ανάλυση παρουσιάζονται σε αυτή την εργασία.
Ώρα δημοσίευσης: 28 Ιανουαρίου 2026