Το ανθελμινθικό φάρμακο Ν,Ν-διαιθυλο-μ-τολουαμίδιο (DEET) έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την AChE (ακετυλοχολινεστεράση) και έχει πιθανές καρκινογόνες ιδιότητες λόγω υπερβολικής αγγείωσης. Σε αυτή την εργασία, δείχνουμε ότι το DEET διεγείρει ειδικά τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προάγουν την αγγειογένεση, αυξάνοντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου. Το DEET ενεργοποιεί τις κυτταρικές διεργασίες που οδηγούν στην αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της προσκόλλησης. Αυτό σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή NO και έκφραση VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η σίγηση του M3 ή η χρήση φαρμακολογικών αναστολέων M3 εξάλειψε όλες αυτές τις επιδράσεις, υποδηλώνοντας ότι η αγγειογένεση που προκαλείται από DEET είναι ευαίσθητη στο M3. Πειράματα που αφορούν τη σηματοδότηση ασβεστίου σε ενδοθηλιακά και HEK κύτταρα που υπερεκφράζουν υποδοχείς M3, καθώς και μελέτες σύνδεσης και πρόσδεσης, δείχνουν ότι το DEET δρα ως αλλοστερικός ρυθμιστής των υποδοχέων M3. Επιπλέον, το DEET αναστέλλει την AChE, αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα της ακετυλοχολίνης και τη σύνδεσή της με τους υποδοχείς M3, και ενισχύοντας τις προαγγειογενετικές επιδράσεις μέσω αλλοστερικής ρύθμισης.
Τα πρωτογενή ECs απομονώθηκαν από την αορτή ελβετικών ποντικών. Η μέθοδος εκχύλισης προσαρμόστηκε από το πρωτόκολλο Kobayashi 26. Τα ECs ποντικών καλλιεργήθηκαν σε μέσο EBM-2 συμπληρωμένο με 5% θερμικά απενεργοποιημένο FBS μέχρι την τέταρτη διέλευση.
Η επίδραση δύο συγκεντρώσεων DEET στον πολλαπλασιασμό των HUVEC, U87MG ή BF16F10 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού κυττάρων CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Εν συντομία, 5,103 κύτταρα ανά φρεάτιο εμβολιάστηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DEET για 24 ώρες. Μετά την αφαίρεση του μέσου ανάπτυξης, προσθέστε διάλυμα δέσμευσης χρωστικής σε κάθε φρεάτιο της μικροπλάκας και επωάστε τα κύτταρα στους 37 °C για 30 λεπτά. Τα επίπεδα φθορισμού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας πολλαπλών λειτουργιών Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Γερμανία) εξοπλισμένη με φίλτρα διέγερσης 485 nm και φίλτρα εκπομπής 530 nm.
Τα HUVEC εμβολιάστηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων με πυκνότητα 104 κυττάρων ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DEET για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας χρωματομετρική δοκιμασία MTT (Sigma-Aldrich, M5655). Οι τιμές οπτικής πυκνότητας ελήφθησαν σε μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών τρόπων (Mithras LB940) σε μήκος κύματος 570 nm.
Οι επιδράσεις του DEET μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες αγγειογένεσης in vitro. Η θεραπεία με 10-8 M ή 10-5 M DEET αύξησε τον σχηματισμό τριχοειδούς μήκους σε HUVECs (Εικόνα 1a, b, λευκές ράβδοι). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία με συγκεντρώσεις DEET που κυμαίνονταν από 10-14 έως 10-5 M έδειξε ότι το μήκος των τριχοειδών έφτασε σε ένα οροπέδιο στα 10-8 M DEET (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά στην προαγγειογενετική επίδραση in vitro των HUVECs που υποβλήθηκαν σε θεραπεία με DEET στο εύρος συγκεντρώσεων 10-8 M και 10-5 M.
Για να προσδιορίσουμε την επίδραση του DEET στη νεοαγγείωση, πραγματοποιήσαμε μελέτες νεοαγγείωσης in vivo. Μετά από 14 ημέρες, ποντίκια στα οποία εγχύθηκαν ενδοθηλιακά κύτταρα προκαλλιεργημένα με 10-8 M ή 10-5 M DEET έδειξαν σημαντική αύξηση στην περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη (Εικ. 1c, λευκές γραμμές).
Επιπλέον, η νεοαγγείωση που προκαλείται από DEET μελετήθηκε σε ποντίκια που έφεραν ξενομόσχευμα U87MG, τα οποία λάμβαναν ημερήσια (ip) ένεση DEET σε δόση που είναι γνωστό ότι προκαλεί συγκεντρώσεις στο πλάσμα 10-5 M, η οποία είναι φυσιολογική σε εκτεθειμένους ανθρώπους. Σε 23 περιπτώσεις, ανιχνεύσιμοι όγκοι (δηλαδή όγκοι >100 mm3) παρατηρήθηκαν 14 ημέρες μετά την ένεση κυττάρων U87MG σε ποντίκια. Την 28η ημέρα, η ανάπτυξη του όγκου ενισχύθηκε σημαντικά σε ποντίκια που έλαβαν DEET σε σύγκριση με ποντίκια ελέγχου (Εικ. 1d, τετράγωνα). Επιπλέον, η χρώση CD31 των όγκων έδειξε ότι το DEET αύξησε σημαντικά την τριχοειδή επιφάνεια αλλά όχι την πυκνότητα των μικροαγγείων. (Εικ. 1e–g).
Για τον προσδιορισμό του ρόλου των μουσκαρινικών υποδοχέων στον πολλαπλασιασμό που προκαλείται από DETA, χρησιμοποιήθηκε 10-8 M ή 10-5 M DETA παρουσία pFHHSiD (10-7 M, ένας επιλεκτικός ανταγωνιστής του υποδοχέα M3). Θεραπεία των HUVEC. Το pFHHSiD ανέστειλε πλήρως τις πολλαπλασιαστικές ιδιότητες του DETA σε όλες τις συγκεντρώσεις (Πίνακας 1).
Υπό αυτές τις συνθήκες, εξετάσαμε επίσης εάν το DEET θα αύξανε το μήκος των τριχοειδών αγγείων στα κύτταρα HUVEC. Ομοίως, το pFHHSiD απέτρεψε σημαντικά το μήκος των τριχοειδών αγγείων που προκαλείται από το DEET (Εικ. 1a, b, γκρι γραμμές). Επιπλέον, παρόμοια πειράματα πραγματοποιήθηκαν με το M3 siRNA. Αν και το siRNA ελέγχου δεν ήταν αποτελεσματικό στην προώθηση του σχηματισμού τριχοειδών αγγείων, η σίγηση του μουσκαρινικού υποδοχέα M3 κατέστειλε την ικανότητα του DEET να αυξάνει το μήκος των τριχοειδών αγγείων (Εικ. 1a, b, μαύρες γραμμές).
Επιπλέον, τόσο η αγγείωση που προκαλείται από 10-8 M ή 10-5 M DEET in vitro όσο και η νεοαγγείωση in vivo μπλοκαρίστηκαν πλήρως από το pFHHSiD (Εικ. 1c, d, κύκλοι). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το DEET προάγει την αγγειογένεση μέσω μιας οδού ευαίσθητης σε επιλεκτικούς ανταγωνιστές υποδοχέα M3 ή σε M3 siRNA.
Η AChE είναι ο μοριακός στόχος του DEET. Φάρμακα όπως η δονεπεζίλη, τα οποία δρουν ως αναστολείς της AChE, μπορούν να διεγείρουν την αγγειογένεση των εξωκυτταρικών κυττάρων in vitro και σε μοντέλα ισχαιμίας οπίσθιων άκρων ποντικού14. Εξετάσαμε την επίδραση δύο συγκεντρώσεων DEET στην ενζυμική δραστικότητα της AChE σε HUVEC. Χαμηλές (10-8 M) και υψηλές (10-5 M) συγκεντρώσεις DEET μείωσαν την ενδοθηλιακή δραστικότητα της AChE σε σύγκριση με τις συνθήκες ελέγχου (Εικ. 2).
Και οι δύο συγκεντρώσεις DEET (10-8 M και 10-5 M) μείωσαν τη δραστικότητα της ακετυλοχολινεστεράσης στα HUVEC. Το BW284c51 (10-5 M) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για τους αναστολείς της ακετυλοχολινεστεράσης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό δραστικότητας AChE σε HUVEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με τις δύο συγκεντρώσεις DEET σε σύγκριση με τα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε αγωγή με φορέα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM έξι ανεξάρτητων πειραμάτων. *p < 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο (δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Kruskal-Wallis και Dunn).
Το μονοξείδιο του αζώτου (NO) εμπλέκεται στη διαδικασία αγγειογένεσης 33, επομένως, μελετήθηκε η παραγωγή NO σε HUVEC που διεγείρονται από DEET. Η παραγωγή ενδοθηλιακού NO που υποβλήθηκε σε αγωγή με DEET αυξήθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αλλά έφτασε σε σημαντικό βαθμό μόνο σε δόση 10-8 M (Εικ. 3c). Για να προσδιοριστούν οι μοριακές αλλαγές που ελέγχουν την παραγωγή NO που προκαλείται από DEET, η έκφραση και η ενεργοποίηση της eNOS αναλύθηκαν με Western blotting. Αν και η αγωγή με DEET δεν άλλαξε την έκφραση της eNOS, αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση της eNOS στη θέση ενεργοποίησής της (Ser-1177) ενώ μείωσε τη θέση αναστολής της (Thr-495) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα στη φωσφορυλίωση της eNOS (Εικ. 3d). Επιπλέον, η αναλογία φωσφορυλιωμένης eNOS στη θέση ενεργοποίησης και στη θέση αναστολής υπολογίστηκε μετά την ομαλοποίηση της ποσότητας φωσφορυλιωμένης eNOS προς τη συνολική ποσότητα ενζύμου. Αυτή η αναλογία αυξήθηκε σημαντικά σε HUVEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε συγκέντρωση DEET σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 3d).
Τέλος, η έκφραση του VEGF, ενός από τους κύριους προαγγειογενετικούς παράγοντες, αναλύθηκε με Western blotting. Το DEET αύξησε σημαντικά την έκφραση του VEGF, ενώ το pFHHSiD ανέστειλε πλήρως αυτήν την έκφραση.
Δεδομένου ότι οι επιδράσεις του DEET είναι ευαίσθητες τόσο στον φαρμακολογικό αποκλεισμό όσο και στην καταστολή των υποδοχέων M3, εξετάσαμε την υπόθεση ότι το DEET μπορεί να ενισχύσει την σηματοδότηση ασβεστίου. Παραδόξως, το DEET απέτυχε να αυξήσει το κυτταροπλασματικό ασβέστιο σε HUVEC (δεδομένα δεν παρουσιάζονται) και HEK/M3 (Εικ. 4α, β) και για τις δύο συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν.
Ώρα δημοσίευσης: 30 Δεκεμβρίου 2024