Το ανθελμινθικό φάρμακο Ν,Ν-διαιθυλ-μ-τολουαμίδιο (DEET) έχει αναφερθεί ότι αναστέλλει την AChE (ακετυλοχολινεστεράση) και έχει πιθανές καρκινογόνες ιδιότητες λόγω υπερβολικής αγγείωσης. Σε αυτό το άρθρο, δείχνουμε ότι το DEET διεγείρει συγκεκριμένα τα ενδοθηλιακά κύτταρα που προάγουν την αγγειογένεση, αυξάνοντας έτσι την ανάπτυξη του όγκου. Το DEET ενεργοποιεί κυτταρικές διεργασίες που οδηγούν σε αγγειογένεση, συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της μετανάστευσης και της προσκόλλησης. Αυτό σχετίζεται με αυξημένη παραγωγή ΝΟ και έκφραση VEGF στα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η σίγαση του Μ3 ή η χρήση φαρμακολογικών αναστολέων του Μ3 κατάργησαν όλες αυτές τις επιδράσεις, υποδηλώνοντας ότι η επαγόμενη από το DEET αγγειογένεση είναι ευαίσθητη στο Μ3. Πειράματα που περιλαμβάνουν σηματοδότηση ασβεστίου σε ενδοθηλιακά κύτταρα και κύτταρα ΗΕΚ που υπερεκφράζουν τους υποδοχείς Μ3, καθώς και μελέτες δέσμευσης και σύνδεσης, δείχνουν ότι το DEET δρα ως αλλοστερικός ρυθμιστής των υποδοχέων Μ3. Επιπλέον, το DEET αναστέλλει την AChE, αυξάνοντας έτσι τη βιοδιαθεσιμότητα της ακετυλοχολίνης και τη δέσμευσή της στους υποδοχείς Μ3 και ενισχύοντας τα προαγγειογενετικά αποτελέσματα μέσω της αλλοστερικής ρύθμισης.
Τα πρωτογενή ECs απομονώθηκαν από την αορτή ελβετικών ποντικών. Η μέθοδος εκχύλισης προσαρμόστηκε από το πρωτόκολλο Kobayashi 26 . Τα ECs ποντικού καλλιεργήθηκαν σε μέσο EBM-2 συμπληρωμένο με 5% αδρανοποιημένο με θερμότητα FBS μέχρι την τέταρτη διέλευση.
Η επίδραση δύο συγκεντρώσεων DEET στον πολλαπλασιασμό των HUVEC, U87MG ή BF16F10 αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας πολλαπλασιασμού κυττάρων CyQUANT (Molecular Probes, C7026). Εν συντομία, 5.103 κύτταρα ανά φρεάτιο σπάρθηκαν σε μια πλάκα 96 φρεατίων, αφέθηκαν να προσκολληθούν όλη τη νύχτα και στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DEET για 24 ώρες. Μετά την αφαίρεση του μέσου ανάπτυξης, προσθέστε διάλυμα δέσμευσης βαφής σε κάθε φρεάτιο της μικροπλάκας και επωάστε τα κύτταρα στους 37 °C για 30 λεπτά. Τα επίπεδα φθορισμού προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Γερμανία) εξοπλισμένη με φίλτρα διέγερσης 485 nm και φίλτρα εκπομπής 530 nm.
Τα HUVEC σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 104 κυττάρων ανά φρεάτιο. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DEET για 24 ώρες. Η βιωσιμότητα των κυττάρων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μια χρωματομετρική δοκιμασία ΜΤΤ (Sigma-Aldrich, Μ5655). Οι τιμές οπτικής πυκνότητας λήφθηκαν σε συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών λειτουργιών (Mithras LB940) σε μήκος κύματος 570 nm.
Τα αποτελέσματα του DEET μελετήθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασίες αγγειογένεσης in vitro. Η θεραπεία με 10-8 M ή 10-5 M DEET αύξησε το σχηματισμό τριχοειδούς μήκους στα HUVECs (Εικ. 1a, b, λευκές ράβδοι). Σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, η θεραπεία με συγκεντρώσεις DEET που κυμαίνονταν από 10-14 έως 10-5 M έδειξε ότι το μήκος των τριχοειδών έφτασε σε ένα επίπεδο στα 10-8 M DEET (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά στην in vitro προαγγειογενετική δράση των HUVEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με DEET στο εύρος συγκεντρώσεων 10-8 M και 10-5 M.
Για να προσδιορίσουμε την επίδραση του DEET στη νεοαγγείωση, πραγματοποιήσαμε in vivo μελέτες νεοαγγείωσης. Μετά από 14 ημέρες, τα ποντίκια στα οποία έγινε ένεση με ενδοθηλιακά κύτταρα προκαλλιεργημένα με 10-8 Μ ή 10-5 Μ DEET έδειξαν σημαντική αύξηση στην περιεκτικότητα σε αιμοσφαιρίνη (Εικ. 1γ, λευκές ράβδοι).
Επιπλέον, η επαγόμενη από το DEET νεοαγγείωση μελετήθηκε σε ποντίκια που έφεραν ξενομόσχευμα U87MG στα οποία χορηγούνταν καθημερινά (IP) ένεση DEET σε μια δόση που είναι γνωστό ότι επάγει συγκεντρώσεις στο πλάσμα 10-5 M, κάτι που είναι φυσιολογικό σε εκτεθειμένους ανθρώπους. σε 23. Ανιχνεύσιμοι όγκοι (δηλ. όγκοι >100 mm3) παρατηρήθηκαν 14 ημέρες μετά την ένεση των κυττάρων U87MG σε ποντικούς. Την ημέρα 28, η ανάπτυξη του όγκου ενισχύθηκε σημαντικά σε ποντικούς που έλαβαν DEET σε σύγκριση με ποντικούς ελέγχου (Εικ. 1d, τετράγωνα). Επιπλέον, η χρώση όγκων με CD31 έδειξε ότι το DEET αύξησε σημαντικά την τριχοειδική περιοχή αλλά όχι την πυκνότητα των μικροαγγείων. (Εικ. 1ε–ζ).
Για να προσδιοριστεί ο ρόλος των μουσκαρινικών υποδοχέων στον επαγόμενο από DETA πολλαπλασιασμό, χρησιμοποιήθηκε 10-8 Μ ή 10-5 Μ DETA παρουσία pFHHSiD (10-7 Μ, ένας εκλεκτικός ανταγωνιστής υποδοχέα Μ3). Θεραπεία του HUVEC. Το pFHHSiD απέκλεισε πλήρως τις πολλαπλασιαστικές ιδιότητες του DETA σε όλες τις συγκεντρώσεις (Πίνακας 1).
Υπό αυτές τις συνθήκες, εξετάσαμε επίσης εάν το DEET θα αύξανε το μήκος των τριχοειδών στα κύτταρα HUVEC. Ομοίως, το pFHHSiD απέτρεψε σημαντικά το επαγόμενο από το DEET μήκος τριχοειδών αγγείων (Εικ. 1a, b, γκρίζες ράβδοι). Επιπλέον, παρόμοια πειράματα πραγματοποιήθηκαν με M3 siRNA. Αν και το siRNA ελέγχου δεν ήταν αποτελεσματικό στην προαγωγή του σχηματισμού τριχοειδών, η σίγαση του μουσκαρινικού υποδοχέα Μ3 κατάργησε την ικανότητα του DEET να αυξάνει το μήκος των τριχοειδών (Εικ. 1a, b, μαύρες ράβδοι).
Επιπλέον, τόσο η επαγόμενη από 10-8 Μ όσο και η 10-5 Μ DEET αγγείωση in vitro και η νεοαγγείωση in vivo αποκλείστηκαν πλήρως από το pFHHSiD (Εικ. 1c, d, κύκλοι). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το DEET προάγει την αγγειογένεση μέσω μιας οδού ευαίσθητης σε εκλεκτικούς ανταγωνιστές υποδοχέα Μ3 ή M3 siRNA.
Η AChE είναι ο μοριακός στόχος του DEET. Φάρμακα όπως η δονεπεζίλη, που δρουν ως αναστολείς της AChE, μπορούν να διεγείρουν την αγγειογένεση EC in vitro και σε μοντέλα ισχαιμίας οπίσθιου άκρου ποντικού14. Δοκιμάσαμε την επίδραση δύο συγκεντρώσεων DEET στη δραστηριότητα του ενζύμου AChE στο HUVEC. Οι χαμηλές (10-8 M) και οι υψηλές (10-5 M) συγκεντρώσεις DEET μείωσαν τη δραστηριότητα της ενδοθηλιακής AChE σε σύγκριση με τις συνθήκες ελέγχου (Εικ. 2).
Και οι δύο συγκεντρώσεις DEET (10-8 Μ και 10-5 Μ) μείωσαν τη δραστηριότητα της ακετυλχολινεστεράσης στο HUVEC. Το BW284c51 (10-5 Μ) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για αναστολείς ακετυλοχολινεστεράσης. Τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ποσοστό της δραστικότητας της AChE σε HUVEC που έχει υποστεί επεξεργασία με τις δύο συγκεντρώσεις DEET σε σύγκριση με κύτταρα που έχουν υποστεί αγωγή με όχημα. Οι τιμές εκφράζονται ως μέσος όρος ± SEM έξι ανεξάρτητων πειραμάτων. *p < 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο (δοκιμή πολλαπλής σύγκρισης Kruskal-Wallis και Dunn).
Το μονοξείδιο του αζώτου (ΝΟ) εμπλέκεται στην αγγειογενετική διαδικασία 33, επομένως, μελετήθηκε η παραγωγή ΝΟ σε HUVECs που διεγείρονται με DEET. Η παραγωγή ενδοθηλίου ΝΟ που υποβλήθηκε σε αγωγή με DEET αυξήθηκε σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, αλλά έφτασε σε σημαντικό βαθμό μόνο σε δόση 10-8 Μ (Εικ. 3γ). Για τον προσδιορισμό των μοριακών αλλαγών που ελέγχουν την επαγόμενη από DEET παραγωγή ΝΟ, η έκφραση και η ενεργοποίηση του eNOS αναλύθηκαν με στύπωμα Western. Αν και η θεραπεία με DEET δεν άλλαξε την έκφραση eNOS, αύξησε σημαντικά τη φωσφορυλίωση eNOS στη θέση ενεργοποίησής της (Ser-1177) ενώ μείωσε την ανασταλτική της θέση (Thr-495) σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα στη φωσφορυλίωση eNOS (Εικ. 3d). Επιπλέον, ο λόγος του φωσφορυλιωμένου eNOS στη θέση ενεργοποίησης και στη θέση αναστολής υπολογίστηκε μετά την κανονικοποίηση της ποσότητας του φωσφορυλιωμένου eNOS προς τη συνολική ποσότητα του ενζύμου. Αυτή η αναλογία αυξήθηκε σημαντικά σε HUVEC που υποβλήθηκαν σε αγωγή με κάθε συγκέντρωση DEET σε σύγκριση με κύτταρα που δεν είχαν υποστεί αγωγή (Εικ. 3d).
Τέλος, η έκφραση του VEGF, ενός από τους κύριους προαγγειογόνους παράγοντες, αναλύθηκε με Western blotting. Το DEET αύξησε σημαντικά την έκφραση του VEGF, ενώ το pFHHSiD απέκλεισε πλήρως αυτήν την έκφραση.
Δεδομένου ότι τα αποτελέσματα του DEET είναι ευαίσθητα τόσο στον φαρμακολογικό αποκλεισμό όσο και στη μείωση της ρύθμισης των υποδοχέων Μ3, δοκιμάσαμε την υπόθεση ότι το DEET μπορεί να ενισχύσει τη σηματοδότηση ασβεστίου. Παραδόξως, το DEET απέτυχε να αυξήσει το κυτταροπλασματικό ασβέστιο στο HUVEC (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και στο HEK/M3 (Εικ. 4α, β) και για τις δύο χρησιμοποιούμενες συγκεντρώσεις.
Ώρα δημοσίευσης: Δεκ-30-2024