Σε αυτή τη μελέτη, οι διεγερτικές επιδράσεις της συνδυασμένης θεραπείαςρυθμιστές ανάπτυξης φυτών(2,4-D και κινετίνη) και νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (Fe₃O₄-NPs) διερευνήθηκαν στην in vitro μορφογένεση και την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών στο *Hypericum perforatum* L. Η βελτιστοποιημένη επεξεργασία [2,4-D (0,5 mg/L) + κινετίνη (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] βελτίωσε σημαντικά τις παραμέτρους ανάπτυξης των φυτών: το ύψος του φυτού αυξήθηκε κατά 59,6%, το μήκος της ρίζας κατά 114,0%, ο αριθμός των μπουμπουκιών κατά 180,0% και το νωπό βάρος του κάλου κατά 198,3% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Αυτή η συνδυασμένη επεξεργασία ενίσχυσε επίσης την αποτελεσματικότητα της αναγέννησης (50,85%) και αύξησε την περιεκτικότητα σε υπερικίνη κατά 66,6%. Η ανάλυση GC-MS αποκάλυψε υψηλή περιεκτικότητα σε υπεροζίτη, β-παθολένιο και κετυλική αλκοόλη, που αντιπροσωπεύει το 93,36% της συνολικής επιφάνειας κορυφής, ενώ η περιεκτικότητα σε ολικά φαινολικά και φλαβονοειδή αυξήθηκε έως και 80,1%. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών (PGRs) και τα νανοσωματίδια Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) ασκούν συνεργιστική δράση διεγείροντας την οργανογένεση και τη συσσώρευση βιοδραστικών ενώσεων, γεγονός που αντιπροσωπεύει μια πολλά υποσχόμενη στρατηγική για τη βιοτεχνολογική βελτίωση των φαρμακευτικών φυτών.
Το βαλσαμόχορτο (Hypericum perforatum L.), επίσης γνωστό ως βαλσαμόχορτο, είναι ένα πολυετές ποώδες φυτό της οικογένειας Hypericaceae που έχει οικονομική αξία.[1] Τα πιθανά βιοδραστικά συστατικά του περιλαμβάνουν φυσικές τανίνες, ξανθόνες, φλωρογλυκινόλη, ναφθαλινοδιανθρόνη (υπερίνη και ψευδοϋπερίνη), φλαβονοειδή, φαινολικά οξέα και αιθέρια έλαια.[2,3,4] Το βαλσαμόχορτο μπορεί να πολλαπλασιαστεί με παραδοσιακές μεθόδους. Ωστόσο, η εποχικότητα των παραδοσιακών μεθόδων, η χαμηλή βλάστηση των σπόρων και η ευαισθησία σε ασθένειες περιορίζουν τις δυνατότητές του για καλλιέργεια μεγάλης κλίμακας και συνεχή σχηματισμό δευτερογενών μεταβολιτών.[1,5,6]
Έτσι, η καλλιέργεια ιστών in vitro θεωρείται μια αποτελεσματική μέθοδος για τον ταχύ πολλαπλασιασμό των φυτών, τη διατήρηση των πόρων του γενετικού υλικού και την αυξημένη απόδοση φαρμακευτικών ενώσεων [7, 8]. Οι ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών (PGR) παίζουν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση της μορφογένεσης και είναι απαραίτητοι για την in vitro καλλιέργεια κάλου και ολόκληρων οργανισμών. Η βελτιστοποίηση των συγκεντρώσεων και των συνδυασμών τους είναι ζωτικής σημασίας για την επιτυχή ολοκλήρωση αυτών των αναπτυξιακών διεργασιών [9]. Επομένως, η κατανόηση της κατάλληλης σύνθεσης και συγκέντρωσης των ρυθμιστών είναι σημαντική για τη βελτίωση της αναπτυξιακής και αναγεννητικής ικανότητας του βαλσαμόχορτου (H. perforatum) [10].
Τα νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (Fe₃O₄) είναι μια κατηγορία νανοσωματιδίων που έχουν αναπτυχθεί ή αναπτύσσονται για ιστοκαλλιέργειες. Το Fe₃O₄ έχει σημαντικές μαγνητικές ιδιότητες, καλή βιοσυμβατότητα και την ικανότητα να προάγει την ανάπτυξη των φυτών και να μειώνει το περιβαλλοντικό στρες, επομένως έχει προσελκύσει σημαντική προσοχή στον σχεδιασμό ιστοκαλλιεργειών. Πιθανές εφαρμογές αυτών των νανοσωματιδίων μπορεί να περιλαμβάνουν τη βελτιστοποίηση της in vitro καλλιέργειας για την προώθηση της κυτταρικής διαίρεσης, τη βελτίωση της πρόσληψης θρεπτικών συστατικών και την ενεργοποίηση αντιοξειδωτικών ενζύμων [11].
Παρόλο που τα νανοσωματίδια έχουν δείξει καλές προωθητικές επιδράσεις στην ανάπτυξη των φυτών, οι μελέτες σχετικά με τη συνδυασμένη εφαρμογή νανοσωματιδίων Fe₃O₄ και βελτιστοποιημένων ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών στο *H. perforatum* παραμένουν σπάνιες. Για να καλυφθεί αυτό το κενό γνώσης, η παρούσα μελέτη αξιολόγησε τις επιδράσεις των συνδυασμένων επιδράσεών τους στη μορφογένεση in vitro και την παραγωγή δευτερογενών μεταβολιτών, ώστε να παρέχει νέες γνώσεις για τη βελτίωση των χαρακτηριστικών των φαρμακευτικών φυτών. Επομένως, η παρούσα μελέτη έχει δύο στόχους: (1) βελτιστοποίηση της συγκέντρωσης των ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών για την αποτελεσματική προώθηση του σχηματισμού κάλων, της αναγέννησης βλαστών και της ριζοβολίας in vitro και (2) αξιολόγηση των επιδράσεων των νανοσωματιδίων Fe₃O₄ στις παραμέτρους ανάπτυξης in vitro. Τα μελλοντικά σχέδια περιλαμβάνουν την αξιολόγηση του ποσοστού επιβίωσης των αναγεννημένων φυτών κατά τον εγκλιματισμό (in vitro). Αναμένεται ότι τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης θα βελτιώσουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα του μικροπολλαπλασιασμού του *H. perforatum*, συμβάλλοντας έτσι στη βιώσιμη χρήση και τις βιοτεχνολογικές εφαρμογές αυτού του σημαντικού φαρμακευτικού φυτού.
Σε αυτήν τη μελέτη, λάβαμε μοσχεύματα φύλλων από ετήσια φυτά St. John's wort (μητρικά φυτά). Αυτά τα μοσχεύματα χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση των συνθηκών καλλιέργειας in vitro. Πριν από την καλλιέργεια, τα φύλλα ξεπλύθηκαν καλά με τρεχούμενο απεσταγμένο νερό για αρκετά λεπτά. Οι επιφάνειες των μοσχευμάτων στη συνέχεια απολυμάνθηκαν με εμβάπτιση σε αιθανόλη 70% για 30 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από εμβάπτιση σε διάλυμα υποχλωριώδους νατρίου (NaOCl) 1,5% που περιείχε μερικές σταγόνες Tween 20 για 10 λεπτά. Τέλος, τα μοσχεύματα ξεπλύθηκαν τρεις φορές με αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό πριν μεταφερθούν στο επόμενο μέσο καλλιέργειας.
Κατά τη διάρκεια των επόμενων τεσσάρων εβδομάδων, μετρήθηκαν οι παράμετροι αναγέννησης των βλαστών, συμπεριλαμβανομένου του ρυθμού αναγέννησης, του αριθμού βλαστών ανά έκφυτο και του μήκους των βλαστών. Όταν οι αναγεννημένοι βλαστοί έφτασαν σε μήκος τουλάχιστον 2 cm, μεταφέρθηκαν σε ένα μέσο ριζοβολίας που αποτελούνταν από μέσο MS μισής περιεκτικότητας, 0,5 mg/L ινδολοβουτυρικό οξύ (IBA) και 0,3% κόμμι γκουάρ. Η καλλιέργεια ριζοβολίας συνεχίστηκε για τρεις εβδομάδες, κατά τη διάρκεια των οποίων μετρήθηκαν ο ρυθμός ριζοβολίας, ο αριθμός ριζών και το μήκος των ριζών. Κάθε επεξεργασία επαναλήφθηκε τρεις φορές, με 10 έκφυτα να καλλιεργούνται ανά επανάληψη, αποδίδοντας περίπου 30 έκφυτα ανά επεξεργασία.
Το ύψος του φυτού μετρήθηκε σε εκατοστά (cm) χρησιμοποιώντας χάρακα, από τη βάση του φυτού έως την άκρη του ψηλότερου φύλλου. Το μήκος της ρίζας μετρήθηκε σε χιλιοστά (mm) αμέσως μετά την προσεκτική αφαίρεση των σπορόφυτων και την αφαίρεση του καλλιεργητικού υποστρώματος. Ο αριθμός των μπουμπουκιών ανά έκφυτο μετρήθηκε απευθείας σε κάθε φυτό. Ο αριθμός των μαύρων κηλίδων στα φύλλα, γνωστών ως οζίδια, μετρήθηκε οπτικά. Αυτά τα μαύρα οζίδια πιστεύεται ότι είναι αδένες που περιέχουν υπερικίνη ή οξειδωτικές κηλίδες και χρησιμοποιούνται ως φυσιολογικός δείκτης της απόκρισης του φυτού στη θεραπεία. Μετά την αφαίρεση όλου του καλλιεργητικού υποστρώματος, το φρέσκο βάρος των σπορόφυτων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτρονική ζυγαριά με ακρίβεια χιλιοστογράμμων (mg).
Η μέθοδος υπολογισμού του ρυθμού σχηματισμού κάλου έχει ως εξής: μετά την καλλιέργεια των μοσχευμάτων σε ένα μέσο που περιέχει διάφορους ρυθμιστές ανάπτυξης (κινάσες, 2,4-D και Fe3O4) για τέσσερις εβδομάδες, μετράται ο αριθμός των μοσχευμάτων που είναι ικανά να σχηματίσουν κάλο. Ο τύπος για τον υπολογισμό του ρυθμού σχηματισμού κάλου έχει ως εξής:
Κάθε θεραπεία επαναλήφθηκε τρεις φορές, με τουλάχιστον 10 μοσχεύματα να εξετάζονται σε κάθε επανάληψη.
Ο ρυθμός αναγέννησης αντικατοπτρίζει το ποσοστό του ιστού του κάλου που ολοκληρώνει με επιτυχία τη διαδικασία διαφοροποίησης των οφθαλμών μετά το στάδιο σχηματισμού του κάλου. Αυτός ο δείκτης καταδεικνύει την ικανότητα του ιστού του κάλου να μετασχηματίζεται σε διαφοροποιημένο ιστό και να αναπτύσσεται σε νέα φυτικά όργανα.
Ο συντελεστής ριζοβολίας είναι ο λόγος του αριθμού των κλαδιών που είναι ικανά να ριζώσουν προς τον συνολικό αριθμό κλαδιών. Αυτός ο δείκτης αντικατοπτρίζει την επιτυχία του σταδίου ριζοβολίας, το οποίο είναι κρίσιμο στον μικροπολλαπλασιασμό και τον πολλαπλασιασμό των φυτών, καθώς η καλή ριζοβολία βοηθά τα σπορόφυτα να επιβιώσουν καλύτερα σε συνθήκες ανάπτυξης.
Οι ενώσεις υπερικίνης εκχυλίστηκαν με 90% μεθανόλη. Πενήντα mg αποξηραμένου φυτικού υλικού προστέθηκαν σε 1 ml μεθανόλης και υποβλήθηκαν σε υπερήχους για 20 λεπτά στα 30 kHz σε υπερηχητικό καθαριστικό (μοντέλο A5120-3YJ) σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Μετά την υπερήχηση, το δείγμα φυγοκεντρήθηκε στις 6000 rpm για 15 λεπτά. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε και η απορρόφηση της υπερικίνης μετρήθηκε στα 592 nm χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο Plus-3000 S σύμφωνα με τη μέθοδο που περιγράφεται από τους Conceiçao et al. [14].
Οι περισσότερες θεραπείες με ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών (PGR) και νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (Fe₃O₄-NPs) δεν προκάλεσαν σχηματισμό μαύρων οζιδίων σε αναγεννημένα φύλλα βλαστών. Δεν παρατηρήθηκαν οζίδια σε καμία από τις θεραπείες με 0,5 ή 1 mg/L 2,4-D, 0,5 ή 1 mg/L κινετίνη ή 1, 2 ή 4 mg/L νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου. Μερικοί συνδυασμοί έδειξαν μια μικρή αύξηση στην ανάπτυξη οζιδίων (αλλά όχι στατιστικά σημαντική) σε υψηλότερες συγκεντρώσεις κινετίνης ή/και νανοσωματιδίων οξειδίου του σιδήρου, όπως ο συνδυασμός 2,4-D (0,5–2 mg/L) με κινετίνη (1–1,5 mg/L) και νανοσωματίδια οξειδίου του σιδήρου (2–4 mg/L). Αυτά τα αποτελέσματα φαίνονται στο Σχήμα 2. Τα μαύρα οζίδια αντιπροσωπεύουν αδένες πλούσιους σε υπερικίνη, τόσο φυσικώς απαντώμενους όσο και ωφέλιμους. Σε αυτή τη μελέτη, τα μαύρα οζίδια συσχετίστηκαν κυρίως με καφέτιασμα των ιστών, υποδεικνύοντας ένα ευνοϊκό περιβάλλον για τη συσσώρευση υπερικίνης. Η επεξεργασία με νανοσωματίδια 2,4-D, κινετίνης και Fe₃O₄ προήγαγε την ανάπτυξη του κάλου, μείωσε την καφετιά όψη και αύξησε την περιεκτικότητα σε χλωροφύλλη, υποδηλώνοντας βελτιωμένη μεταβολική λειτουργία και πιθανή μείωση της οξειδωτικής βλάβης [37]. Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τις επιδράσεις της κινετίνης σε συνδυασμό με νανοσωματίδια 2,4-D και Fe₃O₄ στην ανάπτυξη και ανάπτυξη του κάλου του βαλσαμόχορτου (Εικ. 3a–g). Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα νανοσωματίδια Fe₃O₄ έχουν αντιμυκητιακές και αντιμικροβιακές δράσεις [38, 39] και, όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με ρυθμιστές ανάπτυξης φυτών, μπορούν να διεγείρουν τους μηχανισμούς άμυνας των φυτών και να μειώσουν τους δείκτες κυτταρικού στρες [18]. Αν και η βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών ρυθμίζεται γενετικά, η πραγματική τους απόδοση εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από τις περιβαλλοντικές συνθήκες. Οι μεταβολικές και μορφολογικές αλλαγές μπορούν να επηρεάσουν τα επίπεδα των δευτερογενών μεταβολιτών ρυθμίζοντας την έκφραση συγκεκριμένων φυτικών γονιδίων και ανταποκρινόμενοι σε περιβαλλοντικούς παράγοντες. Επιπλέον, οι επαγωγείς μπορούν να ενεργοποιήσουν την ενεργοποίηση νέων γονιδίων, τα οποία με τη σειρά τους διεγείρουν την ενζυμική δραστηριότητα, ενεργοποιώντας τελικά πολλαπλές βιοσυνθετικές οδούς και οδηγώντας στο σχηματισμό δευτερογενών μεταβολιτών. Επιπλέον, μια άλλη μελέτη έδειξε ότι η μείωση της σκίασης αυξάνει την έκθεση στο ηλιακό φως, αυξάνοντας έτσι τις θερμοκρασίες κατά τη διάρκεια της ημέρας στο φυσικό περιβάλλον του *Hypericum perforatum*, γεγονός που συμβάλλει επίσης στην αυξημένη απόδοση υπερικίνης. Με βάση αυτά τα δεδομένα, η παρούσα μελέτη διερεύνησε τον ρόλο των νανοσωματιδίων σιδήρου ως πιθανών επαγωγέων στην ιστοκαλλιέργεια. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι αυτά τα νανοσωματίδια μπορούν να ενεργοποιήσουν γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της εσπεριδίνης μέσω ενζυματικής διέγερσης, οδηγώντας σε αυξημένη συσσώρευση αυτής της ένωσης (Εικ. 2). Επομένως, σε σύγκριση με τα φυτά που αναπτύσσονται υπό φυσικές συνθήκες, μπορεί να υποστηριχθεί ότι η παραγωγή τέτοιων ενώσεων in vivo μπορεί επίσης να ενισχυθεί όταν το μέτριο στρες συνδυάζεται με την ενεργοποίηση γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών. Οι συνδυαστικές θεραπείες γενικά έχουν θετική επίδραση στον ρυθμό αναγέννησης, αλλά σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτό το αποτέλεσμα εξασθενεί. Αξιοσημείωτα, η θεραπεία με 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L κινάση και διαφορετικές συγκεντρώσεις θα μπορούσε ανεξάρτητα και σημαντικά να αυξήσει τον ρυθμό αναγέννησης κατά 50,85% σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου (Εικ. 4c). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι συγκεκριμένοι συνδυασμοί νανοορμονών μπορούν να δράσουν συνεργιστικά για να προωθήσουν την ανάπτυξη των φυτών και την παραγωγή μεταβολιτών, κάτι που έχει μεγάλη σημασία για την ιστοκαλλιέργεια των φαρμακευτικών φυτών. Οι Palmer και Keller [50] έδειξαν ότι η επεξεργασία με 2,4-D θα μπορούσε ανεξάρτητα να προκαλέσει σχηματισμό κάλου στο St. perforatum, ενώ η προσθήκη κινάσης ενίσχυσε σημαντικά τον σχηματισμό και την αναγέννηση του κάλου. Αυτό το αποτέλεσμα οφειλόταν στη βελτίωση της ορμονικής ισορροπίας και στην διέγερση της κυτταρικής διαίρεσης. Οι Bal et al. [51] διαπίστωσαν ότι η επεξεργασία με Fe₃O₄-NP θα μπορούσε ανεξάρτητα να ενισχύσει τη λειτουργία των αντιοξειδωτικών ενζύμων, προωθώντας έτσι την ανάπτυξη των ριζών στο St. perforatum. Τα μέσα καλλιέργειας που περιέχουν νανοσωματίδια Fe₃O₄ σε συγκεντρώσεις 0,5 mg/L, 1 mg/L και 1,5 mg/L βελτίωσαν τον ρυθμό αναγέννησης των φυτών λιναριού [52]. Η χρήση νανοσωματιδίων κινετίνης, 2,4-διχλωροβενζοθειαζολινόνης και Fe₃O₄ βελτίωσε σημαντικά τους ρυθμούς σχηματισμού κάλου και ριζών, ωστόσο, πρέπει να ληφθούν υπόψη οι πιθανές παρενέργειες της χρήσης αυτών των ορμονών για αναγέννηση in vitro. Για παράδειγμα, η μακροχρόνια ή υψηλής συγκέντρωσης χρήση 2,4-διχλωροβενζοθειαζολινόνης ή κινετίνης μπορεί να οδηγήσει σε σωματική κλωνική ποικιλομορφία, οξειδωτικό στρες, ανώμαλη μορφολογία κάλου ή υαλοποίηση. Επομένως, ένας υψηλός ρυθμός αναγέννησης δεν προβλέπει απαραίτητα γενετική σταθερότητα. Όλα τα αναγεννημένα φυτά θα πρέπει να αξιολογούνται χρησιμοποιώντας μοριακούς δείκτες (π.χ. RAPD, ISSR, AFLP) ή κυτταρογενετική ανάλυση για να προσδιοριστεί η ομοιογένεια και η ομοιότητά τους με τα φυτά in vivo [53,54,55].
Αυτή η μελέτη κατέδειξε για πρώτη φορά ότι η συνδυασμένη χρήση ρυθμιστών ανάπτυξης φυτών (2,4-D και κινετίνη) με νανοσωματίδια Fe₃O₄ μπορεί να ενισχύσει τη μορφογένεση και τη συσσώρευση βασικών βιοδραστικών μεταβολιτών (συμπεριλαμβανομένης της υπερικίνης και της υπεροσίδης) στο *Hypericum perforatum*. Το βελτιστοποιημένο θεραπευτικό σχήμα (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L κινετίνη + 4 mg/L Fe₃O₄-NPs) όχι μόνο μεγιστοποίησε τον σχηματισμό κάλων, την οργανογένεση και την απόδοση δευτερογενών μεταβολιτών, αλλά κατέδειξε επίσης μια ήπια επαγωγική δράση, βελτιώνοντας ενδεχομένως την αντοχή του φυτού στο στρες και τη φαρμακευτική του αξία. Ο συνδυασμός της νανοτεχνολογίας και της καλλιέργειας φυτικών ιστών παρέχει μια βιώσιμη και αποτελεσματική πλατφόρμα για μεγάλης κλίμακας in vitro παραγωγή φαρμακευτικών ενώσεων. Αυτά τα αποτελέσματα ανοίγουν το δρόμο για βιομηχανικές εφαρμογές και μελλοντική έρευνα σε μοριακούς μηχανισμούς, βελτιστοποίηση δοσολογίας και γενετική ακρίβεια, συνδέοντας έτσι τη βασική έρευνα για τα φαρμακευτικά φυτά με την πρακτική βιοτεχνολογία.
Ώρα δημοσίευσης: 12 Δεκεμβρίου 2025