Η ανάπτυξη του κορυφαίου μεριστώματος (SAM) είναι ζωτικής σημασίας για την αρχιτεκτονική του στελέχους. Φυτικές ορμόνεςγιββερελίνεςΤα (GAs) διαδραματίζουν βασικό ρόλο στον συντονισμό της ανάπτυξης των φυτών, αλλά ο ρόλος τους στο SAM παραμένει ελάχιστα κατανοητός. Εδώ, αναπτύξαμε έναν αναλογικό βιοαισθητήρα σηματοδότησης GA κατασκευάζοντας την πρωτεΐνη DELLA για να καταστείλει τη βασική ρυθμιστική της λειτουργία στη μεταγραφική απόκριση GA διατηρώντας παράλληλα την υποβάθμισή της κατά την αναγνώριση GA. Αποδεικνύουμε ότι αυτός ο βιοαισθητήρας που βασίζεται στην αποδόμηση καταγράφει με ακρίβεια τις αλλαγές στα επίπεδα GA και την κυτταρική αίσθηση κατά την ανάπτυξη. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον βιοαισθητήρα για να χαρτογραφήσουμε τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο SAM. Δείχνουμε ότι τα υψηλά σήματα GA υπάρχουν κυρίως σε κύτταρα που βρίσκονται μεταξύ των αρχικών οργάνων, τα οποία είναι πρόδρομοι των κυττάρων μεσογονάτου. Χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις κέρδους και απώλειας συνάρτησης, αποδεικνύουμε περαιτέρω ότι το GA ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης κυττάρου, καθιερώνοντας την κανονική κυτταρική οργάνωση των μεσογονάτιων, προωθώντας έτσι την προδιαγραφή μεσογονάτου στο SAM.
Το κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού (SAM), που βρίσκεται στην κορυφή του βλαστού, περιέχει μια θέση από βλαστοκύτταρα των οποίων η δραστηριότητα δημιουργεί πλευρικά όργανα και βλαστικούς κόμβους με αρθρωτό και επαναληπτικό τρόπο καθ' όλη τη διάρκεια της ζωής του φυτού. Κάθε μία από αυτές τις επαναλαμβανόμενες μονάδες, ή κόμβους φυτών, περιλαμβάνει μεσογονάτια και πλάγια όργανα στους κόμβους και μασχαλιαία μεριστώματα στις μασχάλες των φύλλων1. Η ανάπτυξη και η οργάνωση των φυτικών κόμβων αλλάζει κατά την ανάπτυξη. Στο Arabidopsis, η μεσοκομβική ανάπτυξη καταστέλλεται κατά τη διάρκεια του βλαστικού σταδίου και τα μασχαλιαία μεριστώματα παραμένουν αδρανή στις μασχάλες των φύλλων της ροζέτας. Κατά τη μετάβαση στην ανθοφορική φάση, το SAM γίνεται το μερίστωμα της ταξιανθίας, δημιουργώντας επιμήκεις μεσογονάτους και μασχαλιαίους οφθαλμούς, διακλαδώσεις στις μασχάλες των φύλλων του βλαστού και αργότερα άνθη χωρίς φύλλα2. Αν και έχουμε σημειώσει σημαντική πρόοδο στην κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την έναρξη των φύλλων, των λουλουδιών και των κλαδιών, σχετικά λίγα είναι γνωστά για το πώς προκύπτουν τα μεσογονάτια.
Η κατανόηση της χωροχρονικής κατανομής των GA θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση των λειτουργιών αυτών των ορμονών σε διαφορετικούς ιστούς και σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Η οπτικοποίηση της αποδόμησης της σύντηξης RGA-GFP που εκφράζεται υπό τη δράση του δικού της προαγωγέα παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τη ρύθμιση των συνολικών επιπέδων GA στις ρίζες15,16. Ωστόσο, η έκφραση RGA ποικίλλει μεταξύ των ιστών17 και ρυθμίζεται από το GA18. Έτσι, η διαφορική έκφραση του προαγωγέα RGA μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα το μοτίβο φθορισμού που παρατηρείται με το RGA-GFP και επομένως αυτή η μέθοδος δεν είναι ποσοτική. Πιο πρόσφατα, η βιοδραστική φλουορεσκεΐνη (Fl)-σημασμένη GA19,20 αποκάλυψε τη συσσώρευση GA στον ενδοφλοιό της ρίζας και τη ρύθμιση των κυτταρικών επιπέδων της με τη μεταφορά GA. Πρόσφατα, ο αισθητήρας GA FRET nlsGPS1 έδειξε ότι τα επίπεδα GA συσχετίζονται με την επιμήκυνση των κυττάρων στις ρίζες, τα νήματα και τα σκουρόχρωμα υποκοτύλια21. Ωστόσο, όπως είδαμε, η συγκέντρωση GA δεν είναι η μόνη παράμετρος που ελέγχει τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA, καθώς εξαρτάται από πολύπλοκες διαδικασίες ανίχνευσης. Εδώ, βασιζόμενοι στην κατανόησή μας για τα μονοπάτια σηματοδότησης DELLA και GA, αναφέρουμε την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισμό ενός λογομετρικού βιοαισθητήρα βασισμένου στην υποβάθμιση για τη σηματοδότηση GA. Για να αναπτύξουμε αυτόν τον ποσοτικό βιοαισθητήρα, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταλλαγμένο ευαίσθητο στο GA RGA που συντήχθηκε με μια φθορίζουσα πρωτεΐνη και εκφραζόταν παντού στους ιστούς, καθώς και μια φθορίζουσα πρωτεΐνη που δεν είναι ευαίσθητη στο GA. Δείχνουμε ότι οι συγχωνεύσεις μεταλλαγμένων πρωτεϊνών RGA δεν παρεμβαίνουν στην ενδογενή σηματοδότηση GA όταν εκφράζονται πανταχού παρόντα και ότι αυτός ο βιοαισθητήρας μπορεί να ποσοτικοποιήσει τη δραστηριότητα σηματοδότησης που προκύπτει τόσο από την είσοδο GA όσο και από την επεξεργασία σήματος GA από τη συσκευή ανίχνευσης με υψηλή χωροχρονική ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον βιοαισθητήρα για να χαρτογραφήσουμε τη χωροχρονική κατανομή της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και να ποσοτικοποιήσουμε πώς το GA ρυθμίζει την κυτταρική συμπεριφορά στην επιδερμίδα SAM. Δείχνουμε ότι το GA ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης των κυττάρων SAM που βρίσκονται μεταξύ των αρχικών οργάνων, ορίζοντας έτσι την κανονική κυτταρική οργάνωση του μεσογονάτου.
Τέλος, ρωτήσαμε εάν το qmRGA θα μπορούσε να αναφέρει αλλαγές στα ενδογενή επίπεδα GA χρησιμοποιώντας αναπτυσσόμενες υποκοτύλες. Προηγουμένως δείξαμε ότι τα νιτρικά διεγείρουν την ανάπτυξη αυξάνοντας τη σύνθεση GA και, με τη σειρά τους, την αποικοδόμηση του DELLA34. Αντίστοιχα, παρατηρήσαμε ότι το μήκος υποκοτυλίου σε σπορόφυτα pUBQ10::qmRGA που αναπτύχθηκαν υπό άφθονη παροχή νιτρικών αλάτων (10 mM NO3-) ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από αυτό σε σπορόφυτα που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες έλλειψης νιτρικών αλάτων (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α). Σύμφωνα με την ανταπόκριση ανάπτυξης, τα σήματα GA ήταν υψηλότερα σε υποκοτύλια δενδρυλλίων που αναπτύχθηκαν κάτω από συνθήκες 10 mM NO3- από ό,τι σε σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν απουσία νιτρικών (Συμπληρωματικό Σχήμα 6β, γ). Έτσι, το qmRGA επιτρέπει επίσης την παρακολούθηση αλλαγών στη σηματοδότηση GA που προκαλούνται από ενδογενείς αλλαγές στη συγκέντρωση GA.
Για να κατανοήσουμε εάν η δραστηριότητα σηματοδότησης GA που ανιχνεύεται από το qmRGA εξαρτάται από τη συγκέντρωση GA και την αντίληψη GA, όπως αναμενόταν βάσει του σχεδιασμού του αισθητήρα, αναλύσαμε την έκφραση των τριών υποδοχέων GID1 σε φυτικούς και αναπαραγωγικούς ιστούς. Στα σπορόφυτα, η γραμμή αναφοράς GID1-GUS έδειξε ότι τα GID1a και c εκφράζονται σε μεγάλο βαθμό σε κοτυληδόνες (Εικ. 3a-c). Επιπλέον, και οι τρεις υποδοχείς εκφράστηκαν στα φύλλα, στα πλευρικά ριζικά πριμόρδια, στις άκρες των ριζών (εκτός από το καπάκι της ρίζας του GID1b) και στο αγγειακό σύστημα (Εικ. 3a–c). Στην ταξιανθία SAM, εντοπίσαμε σήματα GUS μόνο για τα GID1b και 1c (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a–c). Ο in situ υβριδισμός επιβεβαίωσε αυτά τα πρότυπα έκφρασης και έδειξε περαιτέρω ότι το GID1c εκφράστηκε ομοιόμορφα σε χαμηλά επίπεδα στο SAM, ενώ το GID1b έδειξε υψηλότερη έκφραση στην περιφέρεια του SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 7d-l). Η μεταφραστική σύντηξη pGID1b::2xmTQ2-GID1b αποκάλυψε επίσης ένα διαβαθμισμένο εύρος έκφρασης GID1b, από χαμηλή ή καθόλου έκφραση στο κέντρο του SAM έως υψηλή έκφραση στα όρια του οργάνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 7m). Έτσι, οι υποδοχείς GID1 δεν είναι ομοιόμορφα κατανεμημένοι στους ιστούς και μέσα στους ιστούς. Σε επόμενα πειράματα, παρατηρήσαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) αύξησε την ευαισθησία του qmRGA σε υποκοτύλια σε εξωτερική εφαρμογή GA (Εικ. 3d, e). Αντίθετα, ο φθορισμός που μετρήθηκε με qd17mRGA στο υποκοτύλιο δεν ήταν ευαίσθητος στην επεξεργασία GA3 (Εικ. 3f, g). Και για τις δύο αναλύσεις, τα σπορόφυτα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υψηλές συγκεντρώσεις GA (100 μM GA3) για την αξιολόγηση της ταχείας συμπεριφοράς του αισθητήρα, όπου η ικανότητα σύνδεσης με τον υποδοχέα GID1 ενισχύθηκε ή χάθηκε. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι ο βιοαισθητήρας qmRGA εξυπηρετεί μια συνδυασμένη λειτουργία ως αισθητήρας GA και GA και υποδηλώνουν ότι η διαφορική έκφραση του υποδοχέα GID1 μπορεί να διαμορφώσει σημαντικά την ικανότητα εκπομπής του αισθητήρα.
Μέχρι σήμερα, η κατανομή των σημάτων GA στο SAM παραμένει ασαφής. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε φυτά που εκφράζουν qmRGA και την αναφορά βλαστοκυττάρων pCLV3::mCherry-NLS35 για να υπολογίσουμε ποσοτικούς χάρτες υψηλής ανάλυσης της δραστηριότητας σηματοδότησης GA, εστιάζοντας στο στρώμα L1 (επιδερμίδα; Εικ. 4a, b, βλέπε Μέθοδοι και συμπληρωματικοί έλεγχοι SAM στον βασικό ρόλο a31 της ανάπτυξης). Εδώ, η έκφραση pCLV3::mCherry-NLS παρείχε ένα σταθερό γεωμετρικό σημείο αναφοράς για την ανάλυση της χωροχρονικής κατανομής της δραστηριότητας σηματοδότησης GA37. Αν και το GA θεωρείται απαραίτητο για την ανάπτυξη των πλευρικών οργάνων4, παρατηρήσαμε ότι τα σήματα GA ήταν χαμηλά στο floral primordium (P) ξεκινώντας από το στάδιο P3 (Εικ. 4a, b), ενώ τα νεαρά P1 και P2 primordiums είχαν μέτρια δραστηριότητα παρόμοια με αυτή στην κεντρική περιοχή (Εικ. 4a, b). Ανιχνεύθηκε υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στα όρια του αρχέγονου οργάνου, ξεκινώντας από το P1/P2 (στις πλευρές του ορίου) και κορυφώνοντας στο P4, καθώς και σε όλα τα κύτταρα της περιφερειακής περιοχής που βρίσκονται μεταξύ των αρχέγονων (Εικ. 4a, b και Συμπληρωματικό Σχήμα 8a, b). Αυτή η υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA παρατηρήθηκε όχι μόνο στην επιδερμίδα αλλά επίσης στα στρώματα L2 και άνω L3 (Συμπληρωματικό Σχ. 8β). Το μοτίβο των σημάτων GA που ανιχνεύθηκαν στο SAM χρησιμοποιώντας qmRGA παρέμεινε επίσης αμετάβλητο με την πάροδο του χρόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 8c–f, k). Αν και το κατασκεύασμα qd17mRGA ρυθμίστηκε συστηματικά στο SAM των φυτών T3 από πέντε ανεξάρτητες σειρές που χαρακτηρίσαμε λεπτομερώς, μπορέσαμε να αναλύσουμε τα μοτίβα φθορισμού που ελήφθησαν με το κατασκεύασμα pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Συμπληρωματικό Σχήμα 8g–j, l). Σε αυτή τη γραμμή ελέγχου, μόνο μικρές αλλαγές στην αναλογία φθορισμού εντοπίστηκαν στο SAM, αλλά στο κέντρο SAM παρατηρήσαμε μια σαφή και απροσδόκητη μείωση στο VENUS που σχετίζεται με το TagBFP. Αυτό επιβεβαιώνει ότι το μοτίβο σηματοδότησης που παρατηρείται από το qmRGA αντανακλά την εξαρτώμενη από το GA υποβάθμιση του mRGA-VENUS, αλλά δείχνει επίσης ότι το qmRGA μπορεί να υπερεκτιμήσει τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο κέντρο του μεριστώματος. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ένα μοτίβο σηματοδότησης GA που αντικατοπτρίζει κυρίως την κατανομή των primordia. Αυτή η κατανομή της inter-αρχέγονης περιοχής (IPR) οφείλεται στη σταδιακή εγκαθίδρυση υψηλής δραστηριότητας σηματοδότησης GA μεταξύ του αναπτυσσόμενου αρχέγονου και της κεντρικής περιοχής, ενώ ταυτόχρονα μειώνεται η δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο αρχέγονο (Εικ. 4c, d).
Η κατανομή των υποδοχέων GID1b και GID1c (βλέπε παραπάνω) υποδηλώνει ότι η διαφορική έκφραση των υποδοχέων GA βοηθά στη διαμόρφωση του σχεδίου της δραστηριότητας σηματοδότησης GA στο SAM. Αναρωτηθήκαμε εάν μπορεί να εμπλέκεται διαφορική συσσώρευση GA. Για να διερευνήσουμε αυτήν την πιθανότητα, χρησιμοποιήσαμε τον αισθητήρα nlsGPS1 GA FRET21. Ανιχνεύθηκε αυξημένη συχνότητα ενεργοποίησης στο SAM του nlsGPS1 που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μM GA4+7 για 100 λεπτά (Συμπληρωματικό Σχήμα 9a–e), υποδεικνύοντας ότι το nlsGPS1 ανταποκρίνεται στις αλλαγές στη συγκέντρωση GA στο SAM, όπως συμβαίνει στις ρίζες21. Η χωρική κατανομή της συχνότητας ενεργοποίησης nlsGPS1 αποκάλυψε σχετικά χαμηλά επίπεδα GA στα εξωτερικά στρώματα του SAM, αλλά έδειξε ότι ήταν ανυψωμένα στο κέντρο και στα όρια του SAM (Εικ. 4e και Συμπληρωματικό Σχήμα 9a,c). Αυτό υποδηλώνει ότι το GA κατανέμεται επίσης στο SAM με ένα χωρικό μοτίβο συγκρίσιμο με αυτό που αποκαλύπτεται από το qmRGA. Ως συμπληρωματική προσέγγιση, αντιμετωπίσαμε επίσης το SAM με φθορίζον GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ή μόνο με Fl ως αρνητικό μάρτυρα. Το σήμα Fl κατανεμήθηκε σε όλο το SAM, συμπεριλαμβανομένης της κεντρικής περιοχής και του αρχέγονου, αν και σε χαμηλότερη ένταση (Εικ. 4j και Συμπληρωματικό Σχήμα 10d). Αντίθετα, και τα τρία GA-Fl συσσωρεύτηκαν ειδικά εντός των ορίων του αρχέγονου και σε διάφορους βαθμούς στο υπόλοιπο IPR, με το GA7-Fl να συσσωρεύεται στη μεγαλύτερη περιοχή στο IPR (Εικ. 4k και Συμπληρωματικό Σχήμα 10a,b). Η ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού αποκάλυψε ότι η αναλογία έντασης IPR προς μη IPR ήταν υψηλότερη σε SAM που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με GA-Fl σε σύγκριση με SAM που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με Fl (Εικ. 41 και Συμπληρωματικό Σχήμα 10γ). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GA είναι παρόν σε υψηλότερες συγκεντρώσεις στα κύτταρα IPR που βρίσκονται πλησιέστερα στο όριο του οργάνου. Αυτό υποδηλώνει ότι το πρότυπο της δραστηριότητας σηματοδότησης SAM GA προκύπτει τόσο από τη διαφορική έκφραση των υποδοχέων GA όσο και από τη διαφορική συσσώρευση GA σε κύτταρα IPR κοντά στα όρια οργάνων. Έτσι, η ανάλυσή μας αποκάλυψε ένα απροσδόκητο χωροχρονικό μοτίβο σηματοδότησης GA, με χαμηλότερη δραστηριότητα στο κέντρο και αρχέγονο του SAM και υψηλότερη δραστηριότητα στο IPR στην περιφερειακή περιοχή.
Για να κατανοήσουμε τον ρόλο της διαφορικής δραστηριότητας σηματοδότησης GA στο SAM, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA, της επέκτασης κυττάρου και της κυτταρικής διαίρεσης χρησιμοποιώντας απεικόνιση χρονικής καθυστέρησης σε πραγματικό χρόνο του SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Δεδομένου του ρόλου του GA στη ρύθμιση της ανάπτυξης, αναμενόταν μια θετική συσχέτιση με τις παραμέτρους επέκτασης των κυττάρων. Επομένως, πρώτα συγκρίναμε τους χάρτες δραστηριότητας σηματοδότησης GA με χάρτες του ρυθμού ανάπτυξης της επιφάνειας των κυττάρων (ως υποκατάστατο για την ένταση της κυτταρικής επέκτασης για ένα δεδομένο κύτταρο και για τα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διαίρεση) και με χάρτες ανισοτροπίας ανάπτυξης, που μετρά την κατευθυντικότητα της κυτταρικής επέκτασης (χρησιμοποιείται επίσης εδώ για ένα δεδομένο κύτταρο και για θυγατρικά κύτταρα στη διαίρεση. Οι χάρτες μας του ρυθμού ανάπτυξης της κυτταρικής επιφάνειας SAM είναι συνεπείς με προηγούμενες παρατηρήσεις38,39, με ελάχιστους ρυθμούς ανάπτυξης στο όριο και μέγιστους ρυθμούς ανάπτυξης στα αναπτυσσόμενα λουλούδια (Εικ. 5α). Η ανάλυση του κύριου συστατικού (PCA) έδειξε ότι η δραστηριότητα σηματοδότησης GA συσχετίστηκε αρνητικά με την ένταση ανάπτυξης της κυτταρικής επιφάνειας (Εικόνα 5γ). Δείξαμε επίσης ότι οι κύριοι άξονες διακύμανσης, συμπεριλαμβανομένης της εισόδου σηματοδότησης GA και της έντασης ανάπτυξης, ήταν ορθογώνιοι προς την κατεύθυνση που προσδιορίστηκε από την υψηλή έκφραση CLV3, επιβεβαιώνοντας τον αποκλεισμό κυττάρων από το κέντρο SAM στις υπόλοιπες αναλύσεις. Η ανάλυση συσχέτισης Spearman επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα PCA (Εικόνα 5δ), υποδεικνύοντας ότι τα υψηλότερα σήματα GA στο IPR δεν είχαν ως αποτέλεσμα υψηλότερη επέκταση των κυττάρων. Ωστόσο, η ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε μια ελαφρά θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (Εικόνα 5c, d), υποδηλώνοντας ότι η υψηλότερη σηματοδότηση GA στο IPR επηρεάζει την κατεύθυνση της κυτταρικής ανάπτυξης και πιθανώς τη θέση του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης.
α, β Οι χάρτες θερμότητας της μέσης επιφανειακής ανάπτυξης (α) και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (β) στο SAM υπολογίζονται κατά μέσο όρο σε επτά ανεξάρτητα φυτά (χρησιμοποιούνται ως υποδοχείς για την ισχύ και την κατεύθυνση της επέκτασης των κυττάρων, αντίστοιχα). c Η ανάλυση PCA περιελάμβανε τις ακόλουθες μεταβλητές: σήμα GA, ένταση επιφανειακής ανάπτυξης, ανισοτροπία επιφανειακής ανάπτυξης και έκφραση CLV3. Το συστατικό PCA 1 συσχετίστηκε κυρίως αρνητικά με την ένταση της επιφανειακής ανάπτυξης και θετικά συσχετίστηκε με το σήμα GA. Το συστατικό PCA 2 συσχετίστηκε κυρίως θετικά με την ανισοτροπία της επιφανειακής ανάπτυξης και αρνητικά με την έκφραση του CLV3. Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν τη διακύμανση που εξηγείται από κάθε στοιχείο. d Ανάλυση συσχέτισης Spearman μεταξύ σήματος GA, έντασης επιφανειακής ανάπτυξης και ανισοτροπίας επιφανειακής ανάπτυξης στην κλίμακα ιστού εξαιρουμένης της CZ. Ο αριθμός στα δεξιά είναι η τιμή Spearman rho μεταξύ δύο μεταβλητών. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν περιπτώσεις όπου η συσχέτιση/αρνητική συσχέτιση είναι πολύ σημαντική. e Τρισδιάστατη απεικόνιση των κυττάρων Col-0 SAM L1 με ομοεστιακή μικροσκοπία. Τα νέα κυτταρικά τοιχώματα που σχηματίζονται στο SAM (αλλά όχι στο primordium) στις 10 ώρες χρωματίζονται σύμφωνα με τις τιμές γωνίας τους. Η γραμμή χρώματος εμφανίζεται στην κάτω δεξιά γωνία. Το ένθετο εμφανίζει την αντίστοιχη τρισδιάστατη εικόνα στις 0 ώρες. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. f Τα διαγράμματα πλαισίου εμφανίζουν ρυθμούς κυτταρικής διαίρεσης σε IPR και non-IPR Col-0 SAM (n = 10 ανεξάρτητα φυτά). Η κεντρική γραμμή δείχνει τη διάμεσο και τα όρια του πλαισίου δείχνουν την 25η και 75η εκατοστιαία θέση. Τα μουστάκια υποδεικνύουν τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές που καθορίζονται με το λογισμικό R. Οι τιμές P ελήφθησαν με τη δοκιμή t δύο ουρών του Welch. g, h Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει (ζ) πώς να μετρηθεί η γωνία του νέου κυτταρικού τοιχώματος (ματζέντα) σε σχέση με την ακτινική κατεύθυνση από το κέντρο του SAM (λευκή διακεκομμένη γραμμή) (λαμβάνονται υπόψη μόνο οι τιμές οξείας γωνίας, π.χ. 0–90°) και (η) οι περιφερειακές/πλευρικές και ακτινικές κατευθύνσεις εντός του μεριστικού. i Ιστογράμματα συχνότητας προσανατολισμού επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης κατά μήκος του SAM (σκούρο μπλε), IPR (μεσαίο μπλε) και μη IPR (ανοιχτό μπλε), αντίστοιχα. Οι τιμές P ελήφθησαν από μια δοκιμή Kolmogorov-Smirnov με δύο ουρές. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. j Ιστογράμματα συχνότητας του προσανατολισμού του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης του IPR γύρω από το P3 (ανοιχτό πράσινο), το P4 (μεσαίο πράσινο) και το P5 (σκούρο πράσινο), αντίστοιχα. Οι τιμές P ελήφθησαν από μια δοκιμή Kolmogorov-Smirnov με δύο ουρές. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.
Ως εκ τούτου, διερευνήσαμε στη συνέχεια τη συσχέτιση μεταξύ της σηματοδότησης GA και της δραστηριότητας κυτταρικής διαίρεσης, αναγνωρίζοντας τα νεοσχηματισμένα κυτταρικά τοιχώματα κατά τη διάρκεια της ανάλυσης (Εικ. 5e). Αυτή η προσέγγιση μας επέτρεψε να μετρήσουμε τη συχνότητα και την κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης. Παραδόξως, διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR και στο υπόλοιπο SAM (non-IPR, Σχ. 5στ) ήταν παρόμοια, υποδεικνύοντας ότι οι διαφορές στη σηματοδότηση GA μεταξύ των κυττάρων IPR και των μη IPR δεν επηρεάζουν σημαντικά την κυτταρική διαίρεση. Αυτό, και η θετική συσχέτιση μεταξύ της σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης, μας ώθησαν να εξετάσουμε εάν η δραστηριότητα σηματοδότησης GA θα μπορούσε να επηρεάσει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης. Μετρήσαμε τον προσανατολισμό του νέου κυτταρικού τοιχώματος ως οξεία γωνία σε σχέση με τον ακτινωτό άξονα που συνδέει το κέντρο του μεριστώματος και το κέντρο του νέου κυτταρικού τοιχώματος (Εικ. 5e-i) και παρατηρήσαμε μια σαφή τάση για τα κύτταρα να διαιρούνται σε γωνίες κοντά στις 90° σε σχέση με τον ακτινωτό άξονα, με τις υψηλότερες συχνότητες να παρατηρούνται σε 80° και 80° (70%). (22,62%) (Εικ. 5e,i), που αντιστοιχεί σε κυτταρικές διαιρέσεις στην περιφερειακή/εγκάρσια διεύθυνση (Εικ. 5η). Για να εξετάσουμε τη συμβολή της σηματοδότησης GA σε αυτή τη συμπεριφορά διαίρεσης κυττάρου, αναλύσαμε τις παραμέτρους κυτταρικής διαίρεσης στο IPR και στο μη IPR ξεχωριστά (Εικ. 5i). Παρατηρήσαμε ότι η κατανομή της γωνίας διαίρεσης σε κύτταρα IPR διέφερε από εκείνη σε κύτταρα μη IPR ή σε κύτταρα σε ολόκληρο το SAM, με τα κύτταρα IPR να παρουσιάζουν υψηλότερη αναλογία πλευρικών/κυκλικών κυτταρικών διαιρέσεων, π.χ. 70–80° και 80–90° (33,86% και 30,71%, αντίστοιχα) (Εικ. 5, αντίστοιχα). Έτσι, οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ της υψηλής σηματοδότησης GA και ενός προσανατολισμού επιπέδου διαίρεσης κυττάρου κοντά στην περιφερειακή κατεύθυνση, παρόμοια με τη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (Εικ. 5c, d). Για να εδραιωθεί περαιτέρω η χωρική διατήρηση αυτής της συσχέτισης, μετρήσαμε τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης σε κύτταρα IPR που περιβάλλουν το αρχέγονο ξεκινώντας από το P3, καθώς η υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA ανιχνεύθηκε σε αυτήν την περιοχή ξεκινώντας από το P4 (Εικ. 4). Οι γωνίες διαίρεσης του IPR γύρω από το P3 και το P4 δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, αν και παρατηρήθηκε αυξημένη συχνότητα πλευρικών κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR γύρω από το P4 (Εικ. 5j). Ωστόσο, στα κύτταρα IPR γύρω από το P5, η διαφορά στον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης έγινε στατιστικά σημαντική, με απότομη αύξηση στη συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων (Εικ. 5j). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση GA μπορεί να ελέγξει τον προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο SAM, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές40,41 ότι η υψηλή σηματοδότηση GA μπορεί να προκαλέσει πλευρικό προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR.
Προβλέπεται ότι τα κύτταρα στο IPR δεν θα ενσωματωθούν στα primordia αλλά μάλλον στα internodes2,42,43. Ο εγκάρσιος προσανατολισμός των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR μπορεί να έχει ως αποτέλεσμα την τυπική οργάνωση παράλληλων διαμήκων σειρών επιδερμικών κυττάρων σε μεσογονάτια. Οι παρατηρήσεις μας που περιγράφονται παραπάνω υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση GA πιθανότατα παίζει ρόλο σε αυτή τη διαδικασία ρυθμίζοντας την κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης.
Η απώλεια της λειτουργίας αρκετών γονιδίων DELLA έχει ως αποτέλεσμα μια συστατική απόκριση GA και τα μεταλλάγματα della μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον έλεγχο αυτής της υπόθεσης44. Αρχικά αναλύσαμε τα πρότυπα έκφρασης πέντε γονιδίων DELLA στο SAM. Η μεταγραφική σύντηξη της γραμμής GUS45 αποκάλυψε ότι τα GAI, RGA, RGL1 και RGL2 (σε πολύ μικρότερο βαθμό) εκφράστηκαν στο SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 11a–d). Ο in situ υβριδισμός έδειξε περαιτέρω ότι το GAI mRNA συσσωρεύεται ειδικά σε πρωτόγονα και αναπτυσσόμενα άνθη (Συμπληρωματικό Σχήμα 11e). Τα RGL1 και RGL3 mRNA ανιχνεύθηκαν σε όλο τον θόλο SAM και σε παλαιότερα άνθη, ενώ το RGL2 mRNA ήταν πιο άφθονο στη συνοριακή περιοχή (Συμπληρωματικό Σχήμα 11f–h). Η ομοεστιακή απεικόνιση του pRGL3::RGL3-GFP SAM επιβεβαίωσε την έκφραση που παρατηρήθηκε με υβριδισμό in situ και έδειξε ότι η πρωτεΐνη RGL3 συσσωρεύεται στο κεντρικό τμήμα του SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 11i). Χρησιμοποιώντας τη γραμμή pRGA::GFP-RGA, βρήκαμε επίσης ότι η πρωτεΐνη RGA συσσωρεύεται στο SAM, αλλά η αφθονία της μειώνεται στο όριο ξεκινώντας από το P4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 11j). Συγκεκριμένα, τα πρότυπα έκφρασης των RGL3 και RGA είναι σύμφωνα με την υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο IPR, όπως ανιχνεύεται από το qmRGA (Εικ. 4). Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι όλα τα DELLA εκφράζονται στο SAM και ότι η έκφρασή τους καλύπτει συλλογικά ολόκληρο το SAM.
Στη συνέχεια αναλύσαμε τις παραμέτρους κυτταρικής διαίρεσης στα άγριου τύπου SAM (Ler, έλεγχος) και τα gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della πεμπτουλά (παγκόσμια) μεταλλάγματα (Εικ. 6a, b). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική μετατόπιση στην κατανομή των συχνοτήτων γωνίας κυτταρικής διαίρεσης στο della global μεταλλαγμένο SAM σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Εικ. 6c). Αυτή η αλλαγή στο μεταλλαγμένο della global οφειλόταν σε αύξηση της συχνότητας των γωνιών 80–90° (34,71% έναντι 24,55%) και, σε μικρότερο βαθμό, στις γωνίες 70–80° (23,78% έναντι 20,18%), δηλαδή, που αντιστοιχούν σε εγκάρσιες κυτταρικές διαιρέσεις (Εικ. 6c). Η συχνότητα των μη εγκάρσιων διαιρέσεων (0–60°) ήταν επίσης χαμηλότερη στο μεταλλαγμένο della global (Εικ. 6c). Η συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων αυξήθηκε σημαντικά στο SAM του μεταλλάγματος della global (Εικ. 6β). Η συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR ήταν επίσης υψηλότερη στο μεταλλαγμένο della global σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Εικ. 6d). Έξω από την περιοχή IPR, ο άγριος τύπος είχε μια πιο ομοιόμορφη κατανομή των γωνιών κυτταρικής διαίρεσης, ενώ το μεταλλαγμένο della global προτιμούσε εφαπτομενικές διαιρέσεις όπως το IPR (Εικ. 6e). Επίσης ποσοτικοποιήσαμε τον προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο SAM των πενταπλών μεταλλαγμάτων ga2 οξειδάσης (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 και ga2ox6-2), ένα GA-αδρανές μεταλλαγμένο υπόβαθρο στο οποίο συσσωρεύεται το GA. Σε συμφωνία με την αύξηση των επιπέδων GA, το SAM της πενταπλής ταξιανθίας μεταλλαγμένης ga2ox ήταν μεγαλύτερη από εκείνη της Col-0 (Συμπληρωματικό Σχήμα 12a, b) και σε σύγκριση με το Col-0, το πενταπλό ga2ox SAM παρουσίασε μια ευδιάκριτα διαφορετική κατανομή των γωνιών κυτταρικής διαίρεσης από 9° σε 50° και πάλι αυξανόμενη. διαιρέσεις (Συμπληρωματικό Σχ. 12α–γ). Έτσι, δείχνουμε ότι η συστατική ενεργοποίηση της σηματοδότησης GA και η συσσώρευση GA προκαλούν πλευρικές κυτταρικές διαιρέσεις στο IPR και στο υπόλοιπο SAM.
a, b Τρισδιάστατη απεικόνιση του στρώματος L1 του Ler (a) που έχει χρωματιστεί με PI και του παγκόσμιου μεταλλάγματος della (b) SAM χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία. Τα νέα κυτταρικά τοιχώματα που σχηματίστηκαν στο SAM (αλλά όχι στο primordium) σε μια περίοδο 10 ωρών εμφανίζονται και χρωματίζονται σύμφωνα με τις τιμές γωνίας τους. Το ένθετο δείχνει το SAM στις 0 h. Η γραμμή χρώματος εμφανίζεται στην κάτω δεξιά γωνία. Το βέλος στο (β) δείχνει ένα παράδειγμα ευθυγραμμισμένων αρχείων κελιών στο καθολικό μεταλλαγμένο della. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. ce σύγκριση της κατανομής συχνότητας των προσανατολισμών του επιπέδου διαίρεσης κυψελών σε ολόκληρο το SAM (d), IPR (e) και μη IPR (f) μεταξύ Ler και global della. Οι τιμές P ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή Kolmogorov-Smirnov με δύο ουρές. f, g Τρισδιάστατη απεικόνιση ομοεστιακών εικόνων διαγονιδιακών φυτών Col-0 (i) και pCUC2::gai-1-VENUS (j) που έχουν χρωματιστεί με PI. Τα πάνελ (a, b) δείχνουν νέα κυτταρικά τοιχώματα (αλλά όχι primordia) που σχηματίζονται στο SAM εντός 10 ωρών. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. h–j Σύγκριση της κατανομής συχνότητας των προσανατολισμών του επιπέδου διαίρεσης κυττάρων που βρίσκονται σε ολόκληρο το SAM (h), IPR (i) και non-IPR (j) μεταξύ των φυτών Col-0 και pCUC2::gai-1-VENUS. Οι τιμές P ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια δοκιμή Kolmogorov-Smirnov με δύο ουρές.
Στη συνέχεια δοκιμάσαμε την επίδραση της αναστολής της σηματοδότησης GA ειδικά στο IPR. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε τον προαγωγέα κυπέλλου κοτυληδόνας 2 (CUC2) για να οδηγήσουμε την έκφραση μιας κυρίαρχης αρνητικής πρωτεΐνης gai-1 συντηγμένης με την VENUS (στη γραμμή pCUC2::gai-1-VENUS). Στο SAM άγριου τύπου, ο υποκινητής CUC2 οδηγεί την έκφραση των περισσότερων IPR στο SAM, συμπεριλαμβανομένων των κυττάρων οριακών, από το P4 και μετά, και παρόμοια ειδική έκφραση παρατηρήθηκε στα φυτά pCUC2::gai-1-VENUS (βλ. παρακάτω). Η κατανομή των γωνιών κυτταρικής διαίρεσης κατά μήκος του SAM ή του IPR των φυτών pCUC2::gai-1-VENUS δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από εκείνη του άγριου τύπου, αν και απροσδόκητα βρήκαμε ότι τα κύτταρα χωρίς ΔΠΡ σε αυτά τα φυτά διαιρούνται σε υψηλότερη συχνότητα 80-90° (Εικ. 6f-j).
Έχει προταθεί ότι η κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης εξαρτάται από τη γεωμετρία του SAM, ιδιαίτερα από την τάση εφελκυσμού που δημιουργείται από την καμπυλότητα του ιστού46. Επομένως, ρωτήσαμε εάν το σχήμα του SAM άλλαξε στο μεταλλαγμένο della global και στα φυτά pCUC2::gai-1-VENUS. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως12, το μέγεθος του μεταλλαγμένου SAM του della global ήταν μεγαλύτερο από αυτό του άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχήμα 13a, b, d). Ο in situ υβριδισμός του CLV3 και του STM RNA επιβεβαίωσε την επέκταση του μεριστώματος σε μεταλλάξεις della και περαιτέρω έδειξε την πλευρική επέκταση της θέσης των βλαστοκυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 13e, f, h, i). Ωστόσο, η καμπυλότητα SAM ήταν παρόμοια και στους δύο γονότυπους (Συμπληρωματικό Σχήμα 13k, m, n, p). Παρατηρήσαμε παρόμοια αύξηση στο μέγεθος στο gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della τετραπλή μετάλλαξη χωρίς αλλαγή στην καμπυλότητα σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Συμπληρωματικό Σχήμα 13c, d, g, j, l, o, p). Η συχνότητα του προσανατολισμού της κυτταρικής διαίρεσης επηρεάστηκε επίσης στην τετραπλή μετάλλαξη della, αλλά σε μικρότερο βαθμό από τη μονολιθική μετάλλαξη della (Συμπληρωματικό Σχήμα 12d–f). Αυτό το δοσολογικό αποτέλεσμα, μαζί με την έλλειψη επίδρασης στην καμπυλότητα, υποδηλώνει ότι η υπολειπόμενη δραστηριότητα RGL3 στο τετραπλό μεταλλαγμένο Della περιορίζει τις αλλαγές στον προσανατολισμό της κυτταρικής διαίρεσης που προκαλείται από την απώλεια δραστηριότητας DELLA και ότι οι αλλαγές στις πλευρικές κυτταρικές διαιρέσεις συμβαίνουν ως απόκριση σε αλλαγές στη δραστηριότητα σηματοδότησης GA αντί για αλλαγές στη γεωμετρία SAM. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, ο υποκινητής CUC2 οδηγεί την έκφραση IPR στο SAM ξεκινώντας από το P4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 14a, b) και αντίθετα, το pCUC2::gai-1-VENUS SAM είχε μειωμένο μέγεθος αλλά μεγαλύτερη καμπυλότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα 14c–h). Αυτή η αλλαγή στη μορφολογία pCUC2::gai-1-VENUS SAM μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετική κατανομή των μηχανικών τάσεων σε σύγκριση με τον άγριο τύπο, στον οποίο οι υψηλές περιφερειακές τάσεις ξεκινούν σε μικρότερη απόσταση από το κέντρο SAM47. Εναλλακτικά, οι αλλαγές στη μορφολογία του pCUC2::gai-1-VENUS SAM μπορεί να προκύψουν από αλλαγές στις τοπικές μηχανικές ιδιότητες που προκαλούνται από διαγονιδιακή έκφραση48. Και στις δύο περιπτώσεις, αυτό θα μπορούσε να αντισταθμίσει εν μέρει τις επιπτώσεις των αλλαγών στη σηματοδότηση GA αυξάνοντας την πιθανότητα τα κύτταρα να διαιρεθούν στον περιφερειακό/εγκάρσιο προσανατολισμό, εξηγώντας τις παρατηρήσεις μας.
Συνολικά, τα δεδομένα μας επιβεβαιώνουν ότι η υψηλότερη σηματοδότηση GA παίζει ενεργό ρόλο στον πλευρικό προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης κυττάρων στο IPR. Δείχνουν επίσης ότι η καμπυλότητα του μεριστώματος επηρεάζει επίσης τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης των κυττάρων στο IPR.
Ο εγκάρσιος προσανατολισμός του επιπέδου διαίρεσης στο IPR, λόγω της υψηλής δραστηριότητας σηματοδότησης GA, υποδηλώνει ότι το GA προ-οργανώνει ένα ακτινικό αρχείο κυττάρων στην επιδερμίδα εντός του SAM για να ορίσει την κυτταρική οργάνωση που αργότερα θα βρεθεί στον επιδερμικό μεσοκόμματο. Πράγματι, τέτοια αρχεία κυττάρων ήταν συχνά ορατά σε εικόνες SAM των μεταλλαγμένων della global (Εικ. 6b). Έτσι, για να διερευνήσουμε περαιτέρω την αναπτυξιακή λειτουργία του χωρικού προτύπου της σηματοδότησης GA στο SAM, χρησιμοποιήσαμε απεικόνιση με χρονική καθυστέρηση για να αναλύσουμε την χωρική οργάνωση των κυττάρων στο IPR σε άγριου τύπου (Ler και Col-0), μεταλλαγμένα della global και διαγονιδιακά φυτά pCUC2::gai-1-VENUS.
Βρήκαμε ότι το qmRGA έδειξε ότι η δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο IPR αυξήθηκε από το P1/P2 και κορυφώθηκε στο P4 και αυτό το μοτίβο παρέμεινε σταθερό με την πάροδο του χρόνου (Εικ. 4a–f και Συμπληρωματικό Σχήμα 8c–f, k). Για να αναλύσουμε τη χωρική οργάνωση των κυττάρων στο IPR με αυξανόμενο σήμα GA, επισημάναμε τα κύτταρα Ler IPR πάνω και στις πλευρές του P4 σύμφωνα με την αναπτυξιακή τους μοίρα που αναλύθηκε 34 ώρες μετά την πρώτη παρατήρηση, δηλαδή, περισσότερες από δύο φορές πλαστιδίου, επιτρέποντάς μας να παρακολουθούμε κύτταρα IPR κατά την ανάπτυξη του αρχέγονου από P1/P2 σε P4. Χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά χρώματα: κίτρινο για εκείνα τα κύτταρα που ήταν ενσωματωμένα στο primordium κοντά στο P4, πράσινο για αυτά που ήταν στο IPR και μωβ για εκείνα που συμμετείχαν και στις δύο διαδικασίες (Εικ. 7a–c). Στο t0 (0 h), 1-2 στρώματα κυττάρων IPR ήταν ορατά μπροστά από το P4 (Εικ. 7a). Όπως ήταν αναμενόμενο, όταν αυτά τα κύτταρα διαιρέθηκαν, το έκαναν κυρίως μέσω του εγκάρσιου επιπέδου διαίρεσης (Εικ. 7a–c). Παρόμοια αποτελέσματα λήφθηκαν χρησιμοποιώντας το Col-0 SAM (με εστίαση στο P3, του οποίου το περίγραμμα διπλώνει παρόμοια με το P4 στο Ler), αν και σε αυτόν τον γονότυπο η πτυχή που σχηματίστηκε στο ανθικό περίγραμμα έκρυψε τα κύτταρα IPR πιο γρήγορα (Εικ. 7g-i). Έτσι, το σχέδιο διαίρεσης των κυττάρων IPR προ-οργανώνει τα κύτταρα σε ακτινικές σειρές, όπως στα μεσογονάτια. Η οργάνωση των ακτινωτών σειρών και ο εντοπισμός των κυττάρων IPR μεταξύ διαδοχικών οργάνων υποδηλώνουν ότι αυτά τα κύτταρα είναι μεσοκομβικοί πρόγονοι.
Εδώ, αναπτύξαμε έναν αναλογικό βιοαισθητήρα σηματοδότησης GA, qmRGA, που επιτρέπει την ποσοτική χαρτογράφηση της δραστηριότητας σηματοδότησης GA που προκύπτει από συνδυασμένες συγκεντρώσεις υποδοχέα GA και GA, ενώ ελαχιστοποιούμε την παρεμβολή σε ενδογενείς οδούς σηματοδότησης, παρέχοντας έτσι πληροφορίες για τη λειτουργία GA σε κυτταρικό επίπεδο. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσαμε μια τροποποιημένη πρωτεΐνη DELLA, mRGA, η οποία έχει χάσει την ικανότητα να δεσμεύει συνεργάτες αλληλεπίδρασης DELLA, αλλά παραμένει ευαίσθητη στην πρωτεόλυση που προκαλείται από GA. Το qmRGA ανταποκρίνεται τόσο σε εξωγενείς όσο και σε ενδογενείς αλλαγές στα επίπεδα GA και οι δυναμικές του ιδιότητες αίσθησης επιτρέπουν την αξιολόγηση των χωροχρονικών αλλαγών στη δραστηριότητα σηματοδότησης GA κατά την ανάπτυξη. Το qmRGA είναι επίσης ένα πολύ ευέλικτο εργαλείο καθώς μπορεί να προσαρμοστεί σε διαφορετικούς ιστούς αλλάζοντας τον προαγωγέα που χρησιμοποιείται για την έκφρασή του (εάν είναι απαραίτητο) και δεδομένης της συντηρημένης φύσης της οδού σηματοδότησης GA και του μοτίβου PFYRE στα αγγειόσπερμα, είναι πιθανό να μεταφερθεί σε άλλα είδη22. Σε συμφωνία με αυτό, μια ισοδύναμη μετάλλαξη στην πρωτεΐνη SLR1 DELLA ρυζιού (HYY497AAA) αποδείχθηκε επίσης ότι καταστέλλει τη δραστηριότητα καταστολέα ανάπτυξης της SLR1, ενώ μειώνει ελαφρώς την αποικοδόμησή της που προκαλείται από GA, παρόμοια με το mRGA23. Συγκεκριμένα, πρόσφατες μελέτες στο Arabidopsis έδειξαν ότι μια μόνο μετάλλαξη αμινοξέος στον τομέα PFYRE (S474L) άλλαξε τη μεταγραφική δραστηριότητα του RGA χωρίς να επηρεάσει την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με τους εταίρους του μεταγραφικού παράγοντα50. Αν και αυτή η μετάλλαξη είναι πολύ κοντά στις 3 υποκαταστάσεις αμινοξέων που υπάρχουν στο mRGA, οι μελέτες μας δείχνουν ότι αυτές οι δύο μεταλλάξεις αλλάζουν διαφορετικά χαρακτηριστικά του DELLA. Αν και οι περισσότεροι συνεργάτες του μεταγραφικού παράγοντα συνδέονται με τις περιοχές LHR1 και SAW του DELLA26,51, ορισμένα διατηρημένα αμινοξέα στην περιοχή PFYRE μπορεί να βοηθήσουν στη σταθεροποίηση αυτών των αλληλεπιδράσεων.
Η ανάπτυξη μεσογονάτου είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό στην αρχιτεκτονική των φυτών και στη βελτίωση της απόδοσης. Το qmRGA αποκάλυψε υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA σε προγονικά κύτταρα μεσογονάτου IPR. Συνδυάζοντας ποσοτική απεικόνιση και γενετική, δείξαμε ότι τα μοτίβα σηματοδότησης GA υπερτίθενται κυκλικά/εγκάρσια επίπεδα κυτταρικής διαίρεσης στην επιδερμίδα SAM, διαμορφώνοντας την οργάνωση κυτταρικής διαίρεσης που απαιτείται για την ανάπτυξη μεσογονάτου. Κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης έχουν εντοπιστεί αρκετοί ρυθμιστές του προσανατολισμού του επιπέδου διαίρεσης κυττάρων52,53. Η εργασία μας παρέχει ένα σαφές παράδειγμα του τρόπου με τον οποίο η δραστηριότητα σηματοδότησης GA ρυθμίζει αυτήν την κυτταρική παράμετρο. Το DELLA μπορεί να αλληλεπιδράσει με προαναδιπλούμενα πρωτεϊνικά σύμπλοκα41, επομένως η σηματοδότηση GA μπορεί να ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης επηρεάζοντας άμεσα τον προσανατολισμό των μικροσωληνίσκων του φλοιού40,41,54,55. Απροσδόκητα δείξαμε ότι στο SAM, ο συσχετισμός της υψηλότερης δραστηριότητας σηματοδότησης GA δεν ήταν η επιμήκυνση ή η διαίρεση των κυττάρων, αλλά μόνο η ανισοτροπία ανάπτυξης, η οποία είναι σύμφωνη με την άμεση επίδραση του GA στην κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης στο IPR. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι αυτή η επίδραση θα μπορούσε επίσης να είναι έμμεση, για παράδειγμα με τη μεσολάβηση της μαλάκυνσης του κυτταρικού τοιχώματος που προκαλείται από GA56. Οι αλλαγές στις ιδιότητες του κυτταρικού τοιχώματος προκαλούν μηχανικό στρες57,58, το οποίο μπορεί επίσης να επηρεάσει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης επηρεάζοντας τον προσανατολισμό των μικροσωληνίσκων του φλοιού39,46,59. Οι συνδυασμένες επιδράσεις της μηχανικής καταπόνησης που προκαλείται από GA και της άμεσης ρύθμισης του προσανατολισμού των μικροσωληνίσκων από το GA μπορεί να εμπλέκονται στη δημιουργία ενός συγκεκριμένου μοτίβου προσανατολισμού κυτταρικής διαίρεσης στο IPR για τον ορισμό των μεσογονάκων και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα. Ομοίως, προηγούμενες μελέτες έχουν υπογραμμίσει τη σημασία των πρωτεϊνών TCP14 και 15 που αλληλεπιδρούν με DELLA στον έλεγχο του σχηματισμού μεσογονάτου60,61 και αυτοί οι παράγοντες μπορεί να μεσολαβούν στη δράση του GA μαζί με το BREVIPEDICELLUS (BP) και το PENNYWISE (PNY), που ρυθμίζουν την ανάπτυξη μεσογονάτου και έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν το GA22. Δεδομένου ότι τα DELLA αλληλεπιδρούν με τα σηματοδοτικά μονοπάτια brassinosteroid, αιθυλενίου, jasmonic acid και abscisic acid (ABA)63,64 και ότι αυτές οι ορμόνες μπορούν να επηρεάσουν τον προσανατολισμό των μικροσωληνίσκων65, οι επιδράσεις του GA στον προσανατολισμό της κυτταρικής διαίρεσης μπορεί επίσης να διαμεσολαβούνται από άλλες ορμόνες.
Πρώιμες κυτταρολογικές μελέτες έδειξαν ότι τόσο η εσωτερική όσο και η εξωτερική περιοχή του Arabidopsis SAM απαιτούνται για την ανάπτυξη των μεσογονάκων2,42. Το γεγονός ότι το GA ρυθμίζει ενεργά την κυτταρική διαίρεση στους εσωτερικούς ιστούς12 υποστηρίζει μια διπλή λειτουργία του GA στη ρύθμιση του μεγέθους του μεριστώματος και του μεσογονάτου στο SAM. Το μοτίβο της κατευθυντικής κυτταρικής διαίρεσης ρυθμίζεται επίσης στενά στον εσωτερικό ιστό SAM και αυτή η ρύθμιση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του στελέχους52. Θα είναι ενδιαφέρον να εξεταστεί εάν το GA παίζει επίσης ρόλο στον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης κυττάρων στην εσωτερική οργάνωση SAM, συγχρονίζοντας έτσι την προδιαγραφή και την ανάπτυξη των μεσογονάτιων εντός του SAM.
Τα φυτά αναπτύχθηκαν in vitro σε χώμα ή 1x μέσο Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) συμπληρωμένο με 1% σακχαρόζη και 1% άγαρ (Sigma) υπό τυπικές συνθήκες (16 ώρες φως, 22 °C), εκτός από τα πειράματα ανάπτυξης υποκοτυλίου και ρίζας στα οποία τα σπορόφυτα αναπτύχθηκαν σε κάθετες πλάκες στους 22 °C και υπό σταθερό φως. Για πειράματα νιτρικών, τα φυτά αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο MS (φυτικό μέσο bioWORLD) συμπληρωμένο με επαρκή νιτρικά (0 ή 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-ηλεκτρικό, 1% σακχαρόζη και 1% A-agar (Sigma) υπό συνθήκες μεγάλης ημέρας.
Το GID1a cDNA που εισήχθη στο pDONR221 ανασυνδυάστηκε με pDONR P4-P1R-pUBQ10 και pDONR P2R-P3-mCherry στο pB7m34GW για να δημιουργήσει pUBQ10::GID1a-mCherry. Το IDD2 DNA που εισήχθη στο pDONR221 ανασυνδυάστηκε στο pB7RWG266 για να δημιουργήσει p35S:IDD2-RFP. Για να δημιουργηθεί pGID1b::2xmTQ2-GID1b, ένα θραύσμα 3,9 kb ανάντη της κωδικοποιητικής περιοχής GID1b και ένα θραύσμα 4,7 kb που περιέχει το cDNA GID1b (1,3 kb) και τον τερματιστή (3,4 kb) ενισχύθηκαν πρώτα χρησιμοποιώντας τους εκκινητές στον Συμπληρωματικό Πίνακα και στη συνέχεια ONRmoded σε p. Fisher Scientific) και pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), αντίστοιχα, και τελικά ανασυνδυάστηκαν με το pDONR221 2xmTQ268 στον φορέα στόχο pGreen 012567 χρησιμοποιώντας κλωνοποίηση Gateway. Για να δημιουργηθεί pCUC2::LSSmOrange, η αλληλουχία προαγωγέα CUC2 (3229 bp ανάντη του ATG) ακολουθούμενη από την κωδικοποιητική αλληλουχία του μεγάλου Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange)69 με το σήμα πυρηνικού εντοπισμού N7 και τον μεταγραφικό τερματιστή NOS συναρμολογήθηκαν στο στόχευση του pG. Σύστημα ανασυνδυασμού 3 θραυσμάτων (Invitrogen). Ο φυτικός δυαδικός φορέας εισήχθη στο στέλεχος Agrobacterium tumefaciens GV3101 και εισήχθη στα φύλλα Nicotiana benthamiana με τη μέθοδο διήθησης Agrobacterium και στο Arabidopsis thaliana Col-0 με τη μέθοδο floral dip, αντίστοιχα. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry και pCLV3::mCherry-NLS qmRGA απομονώθηκαν από τους απογόνους F3 και F1 των αντίστοιχων διασταυρώσεων, αντίστοιχα.
Ο υβριδισμός RNA επί τόπου διεξήχθη σε άκρες βλαστών μήκους περίπου 1 cm72, οι οποίες συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν αμέσως σε διάλυμα FAA (3,7% φορμαλδεΰδη, 5% οξικό οξύ, 50% αιθανόλη) προψυγμένο στους 4 °C. Μετά από 2 χ 15 λεπτά επεξεργασίες κενού, το σταθεροποιητικό άλλαξε και τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Τα cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 και RGL3 και αντιπληροφοριακά ανιχνευτές στα 3'-UTRs τους συντέθηκαν χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 όπως περιγράφεται από τους Rosier et al.73. Οι επισημασμένοι με διγοξιγενίνη ανιχνευτές ανοσοανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα διγοξιγενίνης (3000 φορές αραίωση, Roche, αριθμός καταλόγου: 11 093 274 910) και οι τομές χρωματίστηκαν με 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλοφωσφορικό (BCIP-5-τετροφυλλολιούχο) (NBT, αραίωση 200 φορές).
Ώρα δημοσίευσης: Φεβ-10-2025