Η ανάπτυξη του κορυφαίου μεριστώματος των βλαστών (SAM) είναι κρίσιμη για την αρχιτεκτονική του βλαστού. Φυτικές ορμόνεςγιβερελίνεςΤα GA (GAs) παίζουν βασικούς ρόλους στον συντονισμό της ανάπτυξης των φυτών, αλλά ο ρόλος τους στο SAM παραμένει ελάχιστα κατανοητός. Εδώ, αναπτύξαμε έναν αναλογιομετρικό βιοαισθητήρα σηματοδότησης GA τροποποιώντας την πρωτεΐνη DELLA για να καταστείλει την απαραίτητη ρυθμιστική της λειτουργία στην μεταγραφική απόκριση του GA, διατηρώντας παράλληλα την υποβάθμισή της κατά την αναγνώριση του GA. Δείχνουμε ότι αυτός ο βιοαισθητήρας που βασίζεται στην υποβάθμιση καταγράφει με ακρίβεια τις αλλαγές στα επίπεδα του GA και την κυτταρική ανίχνευση κατά την ανάπτυξη. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον βιοαισθητήρα για να χαρτογραφήσουμε τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο SAM. Δείχνουμε ότι υψηλά σήματα GA υπάρχουν κυρίως σε κύτταρα που βρίσκονται μεταξύ των πρωτογενών οργάνων, τα οποία είναι πρόδρομοι των κυττάρων των μεσογονατίων. Χρησιμοποιώντας προσεγγίσεις κέρδους και απώλειας λειτουργίας, αποδεικνύουμε περαιτέρω ότι το GA ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης, καθιερώνοντας την κανονική κυτταρική οργάνωση των μεσογονατίων, προωθώντας έτσι την προδιαγραφή των μεσογονατίων στο SAM.
Το κορυφαίο μερίστωμα του βλαστού (SAM), που βρίσκεται στην κορυφή του βλαστού, περιέχει μια εσοχή βλαστοκυττάρων των οποίων η δραστηριότητα παράγει πλευρικά όργανα και βλαστικούς κόμβους με αρθρωτό και επαναληπτικό τρόπο καθ' όλη τη διάρκεια ζωής του φυτού. Κάθε μία από αυτές τις επαναλαμβανόμενες μονάδες, ή φυτικούς κόμβους, περιλαμβάνει μεσογονάτια και πλευρικά όργανα στους κόμβους, και μασχαλιαία μερίστωμα στις μασχάλες των φύλλων1. Η ανάπτυξη και η οργάνωση των φυτικών κόμβων αλλάζει κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Στο Arabidopsis, η μεσογονάτια ανάπτυξη καταστέλλεται κατά το βλαστικό στάδιο, και τα μασχαλιαία μερίστωμα παραμένουν αδρανή στις μασχάλες των φύλλων ροζέτας. Κατά τη μετάβαση στη φάση της ανθοφορίας, το SAM γίνεται το μερίστωμα της ταξιανθίας, δημιουργώντας επιμήκη μεσογονάτια και μασχαλιαίους οφθαλμούς, κλαδάκια στις μασχάλες των φύλλων του βλαστού και αργότερα, άνθη χωρίς φύλλα2. Αν και έχουμε σημειώσει σημαντική πρόοδο στην κατανόηση των μηχανισμών που ελέγχουν την έναρξη των φύλλων, των λουλουδιών και των κλαδιών, σχετικά λίγα είναι γνωστά για το πώς προκύπτουν τα μεσογονάτια.
Η κατανόηση της χωροχρονικής κατανομής των GA θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση των λειτουργιών αυτών των ορμονών σε διαφορετικούς ιστούς και σε διαφορετικά αναπτυξιακά στάδια. Η απεικόνιση της αποικοδόμησης της σύντηξης RGA-GFP που εκφράζεται υπό τη δράση του δικού της υποκινητή παρέχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τη ρύθμιση των συνολικών επιπέδων GA στις ρίζες15,16. Ωστόσο, η έκφραση RGA ποικίλλει μεταξύ των ιστών17 και ρυθμίζεται από τον GA18. Έτσι, η διαφορική έκφραση του υποκινητή RGA μπορεί να οδηγήσει στο πρότυπο φθορισμού που παρατηρείται με τον RGA-GFP και επομένως αυτή η μέθοδος δεν είναι ποσοτική. Πιο πρόσφατα, ο GA19,20 με σήμανση βιοδραστικής φλουορεσκεΐνης (Fl) αποκάλυψε τη συσσώρευση GA στον ενδοφλοιό της ρίζας και τη ρύθμιση των κυτταρικών του επιπέδων μέσω της μεταφοράς GA. Πρόσφατα, ο αισθητήρας GA FRET nlsGPS1 έδειξε ότι τα επίπεδα GA συσχετίζονται με την επιμήκυνση των κυττάρων στις ρίζες, τα νημάτια και τα υποκοτύλια που αναπτύσσονται στο σκοτάδι21. Ωστόσο, όπως έχουμε δει, η συγκέντρωση GA δεν είναι η μόνη παράμετρος που ελέγχει τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA, καθώς εξαρτάται από πολύπλοκες διαδικασίες ανίχνευσης. Εδώ, βασιζόμενοι στην κατανόησή μας για τις οδούς σηματοδότησης DELLA και GA, αναφέρουμε την ανάπτυξη και τον χαρακτηρισμό ενός αναλογιομετρικού βιοαισθητήρα βασισμένου στην αποικοδόμηση για τη σηματοδότηση GA. Για να αναπτύξουμε αυτόν τον ποσοτικό βιοαισθητήρα, χρησιμοποιήσαμε ένα μεταλλαγμένο RGA ευαίσθητο στο GA που ήταν συγχωνευμένο με μια φθορίζουσα πρωτεΐνη και εκφραζόταν πανταχού παρόντα στους ιστούς, καθώς και μια φθορίζουσα πρωτεΐνη μη ευαίσθητη στο GA. Δείχνουμε ότι οι συγχωνεύσεις μεταλλαγμένων πρωτεϊνών RGA δεν παρεμβαίνουν στην ενδογενή σηματοδότηση GA όταν εκφράζονται πανταχού παρόντα και ότι αυτός ο βιοαισθητήρας μπορεί να ποσοτικοποιήσει τη δραστηριότητα σηματοδότησης που προκύπτει τόσο από την είσοδο GA όσο και από την επεξεργασία σήματος GA από τη συσκευή ανίχνευσης με υψηλή χωροχρονική ανάλυση. Χρησιμοποιήσαμε αυτόν τον βιοαισθητήρα για να χαρτογραφήσουμε τη χωροχρονική κατανομή της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και να ποσοτικοποιήσουμε τον τρόπο με τον οποίο το GA ρυθμίζει την κυτταρική συμπεριφορά στην επιδερμίδα SAM. Δείχνουμε ότι το GA ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης των κυττάρων SAM που βρίσκονται μεταξύ των πρωτογενών οργάνων, ορίζοντας έτσι την κανονική κυτταρική οργάνωση του μεσογονατίου.
Τέλος, ρωτήσαμε εάν το qmRGA θα μπορούσε να αναφέρει αλλαγές στα ενδογενή επίπεδα GA χρησιμοποιώντας αναπτυσσόμενα υποκοτύλια. Προηγουμένως δείξαμε ότι τα νιτρικά διεγείρουν την ανάπτυξη αυξάνοντας τη σύνθεση GA και, με τη σειρά τους, την αποικοδόμηση του DELLA34. Συνεπώς, παρατηρήσαμε ότι το μήκος του υποκοτυλίου σε σπορόφυτα pUBQ10::qmRGA που καλλιεργήθηκαν υπό άφθονη παροχή νιτρικών (10 mM NO3−) ήταν σημαντικά μεγαλύτερο από αυτό σε σπορόφυτα που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες έλλειψης νιτρικών (Συμπληρωματικό Σχήμα 6α). Σύμφωνα με την απόκριση ανάπτυξης, τα σήματα GA ήταν υψηλότερα σε υποκοτύλια σπορόφυτων που καλλιεργήθηκαν υπό συνθήκες 10 mM NO3− από ό,τι σε σπορόφυτα που καλλιεργήθηκαν απουσία νιτρικών (Συμπληρωματικό Σχήμα 6b, c). Έτσι, το qmRGA επιτρέπει επίσης την παρακολούθηση των αλλαγών στην σηματοδότηση GA που προκαλούνται από ενδογενείς αλλαγές στη συγκέντρωση GA.
Για να κατανοήσουμε εάν η δραστηριότητα σηματοδότησης GA που ανιχνεύεται από το qmRGA εξαρτάται από τη συγκέντρωση GA και την αντίληψη GA, όπως αναμενόταν με βάση τον σχεδιασμό του αισθητήρα, αναλύσαμε την έκφραση των τριών υποδοχέων GID1 σε βλαστικούς και αναπαραγωγικούς ιστούς. Στα σπορόφυτα, η γραμμή αναφοράς GID1-GUS έδειξε ότι τα GID1a και c εκφράστηκαν σε υψηλά επίπεδα στις κοτυληδόνες (Εικόνα 3a-c). Επιπλέον, και οι τρεις υποδοχείς εκφράστηκαν σε φύλλα, πλευρικά πρωτεύοντα ριζικά κύτταρα, άκρες ριζών (εκτός από το ριζικό κάλυμμα του GID1b) και το αγγειακό σύστημα (Εικόνα 3a-c). Στην ταξιανθία SAM, ανιχνεύσαμε σήματα GUS μόνο για τα GID1b και 1c (Συμπληρωματικό Σχήμα 7a-c). Η υβριδοποίηση in situ επιβεβαίωσε αυτά τα πρότυπα έκφρασης και απέδειξε περαιτέρω ότι το GID1c εκφράστηκε ομοιόμορφα σε χαμηλά επίπεδα στο SAM, ενώ το GID1b έδειξε υψηλότερη έκφραση στην περιφέρεια του SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 7d-l). Η μεταφραστική σύντηξη pGID1b::2xmTQ2-GID1b αποκάλυψε επίσης ένα διαβαθμισμένο εύρος έκφρασης GID1b, από χαμηλή ή καθόλου έκφραση στο κέντρο του SAM έως υψηλή έκφραση στα όρια των οργάνων (Συμπληρωματικό Σχήμα 7m). Έτσι, οι υποδοχείς GID1 δεν κατανέμονται ομοιόμορφα στους ιστούς και εντός αυτών. Σε επόμενα πειράματα, παρατηρήσαμε επίσης ότι η υπερέκφραση του GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) αύξησε την ευαισθησία του qmRGA σε υποκοτύλια στην εξωτερική εφαρμογή GA (Εικόνα 3d, e). Αντίθετα, ο φθορισμός που μετρήθηκε με qd17mRGA στο υποκοτύλιο δεν ήταν ευαίσθητος στην επεξεργασία με GA3 (Εικόνα 3f, g). Και για τις δύο δοκιμασίες, τα σπορόφυτα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υψηλές συγκεντρώσεις GA (100 μM GA3) για να αξιολογηθεί η ταχεία συμπεριφορά του αισθητήρα, όπου η ικανότητα σύνδεσης με τον υποδοχέα GID1 ενισχύθηκε ή χάθηκε. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι ο βιοαισθητήρας qmRGA εξυπηρετεί μια συνδυασμένη λειτουργία ως αισθητήρας GA και GA και υποδηλώνουν ότι η διαφορική έκφραση του υποδοχέα GID1 μπορεί να τροποποιήσει σημαντικά την ικανότητα εκπομπής του αισθητήρα.
Μέχρι σήμερα, η κατανομή των σημάτων GA στο SAM παραμένει ασαφής. Επομένως, χρησιμοποιήσαμε φυτά που εκφράζουν qmRGA και τον ανταποκριτή βλαστοκυττάρων pCLV3::mCherry-NLS35 για να υπολογίσουμε ποσοτικούς χάρτες υψηλής ανάλυσης της δραστηριότητας σηματοδότησης GA, εστιάζοντας στο στρώμα L1 (επιδερμίδα· Σχήμα 4a, b, βλέπε Μέθοδοι και Συμπληρωματικές Μέθοδοι), καθώς το L1 παίζει βασικό ρόλο στον έλεγχο της ανάπτυξης SAM36. Εδώ, η έκφραση pCLV3::mCherry-NLS παρείχε ένα σταθερό γεωμετρικό σημείο αναφοράς για την ανάλυση της χωροχρονικής κατανομής της δραστηριότητας σηματοδότησης GA37. Αν και το GA θεωρείται απαραίτητο για την ανάπτυξη πλευρικών οργάνων4, παρατηρήσαμε ότι τα σήματα GA ήταν χαμηλά στο ανθικό πρωτόγονο (P) ξεκινώντας από το στάδιο P3 (Σχήμα 4a, b), ενώ τα νεαρά πρωτόγονα P1 και P2 είχαν μέτρια δραστηριότητα παρόμοια με αυτή στην κεντρική περιοχή (Σχήμα 4a, b). Υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA ανιχνεύθηκε στα όρια του αρχέγονου οργάνου, ξεκινώντας από το P1/P2 (στις πλευρές του ορίου) και κορυφώνοντας στο P4, καθώς και σε όλα τα κύτταρα της περιφερειακής περιοχής που βρίσκεται μεταξύ των αρχέγονων (Εικόνα 4a, b και Συμπληρωματικό Σχήμα 8a, b). Αυτή η υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA παρατηρήθηκε όχι μόνο στην επιδερμίδα αλλά και στα στρώματα L2 και άνω L3 (Συμπληρωματικό Σχήμα 8b). Το πρότυπο των σημάτων GA που ανιχνεύθηκαν στο SAM χρησιμοποιώντας qmRGA παρέμεινε επίσης αμετάβλητο με την πάροδο του χρόνου (Συμπληρωματικό Σχήμα 8c–f, k). Αν και το κατασκεύασμα qd17mRGA ρυθμίστηκε συστηματικά προς τα κάτω στο SAM των φυτών Τ3 από πέντε ανεξάρτητες γραμμές που χαρακτηρίσαμε λεπτομερώς, καταφέραμε να αναλύσουμε τα πρότυπα φθορισμού που ελήφθησαν με το κατασκεύασμα pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (Συμπληρωματικό Σχήμα 8g–j, l). Σε αυτήν τη γραμμή ελέγχου, ανιχνεύθηκαν μόνο μικρές αλλαγές στον λόγο φθορισμού στο SAM, αλλά στο κέντρο του SAM παρατηρήσαμε μια σαφή και απροσδόκητη μείωση στο VENUS που σχετίζεται με το TagBFP. Αυτό επιβεβαιώνει ότι το πρότυπο σηματοδότησης που παρατηρείται από το qmRGA αντανακλά την εξαρτώμενη από το GA υποβάθμιση του mRGA-VENUS, αλλά καταδεικνύει επίσης ότι το qmRGA μπορεί να υπερεκτιμά τη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο κέντρο του μεριστώματος. Συνοπτικά, τα αποτελέσματά μας αποκαλύπτουν ένα πρότυπο σηματοδότησης GA που αντανακλά κυρίως την κατανομή των πρωταρχικών κυττάρων. Αυτή η κατανομή της δια-πρωταρχικής περιοχής (IPR) οφείλεται στη σταδιακή καθιέρωση υψηλής δραστηριότητας σηματοδότησης GA μεταξύ του αναπτυσσόμενου πρωταρχικού ιστού και της κεντρικής περιοχής, ενώ ταυτόχρονα η δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο πρωταρχικό ιστού μειώνεται (Εικ. 4c, d).
Η κατανομή των υποδοχέων GID1b και GID1c (βλ. παραπάνω) υποδηλώνει ότι η διαφορική έκφραση των υποδοχέων GA βοηθά στη διαμόρφωση του προτύπου της δραστηριότητας σηματοδότησης GA στο SAM. Αναρωτηθήκαμε αν μπορεί να εμπλέκεται διαφορική συσσώρευση GA. Για να διερευνήσουμε αυτήν την πιθανότητα, χρησιμοποιήσαμε τον αισθητήρα nlsGPS1 GA FRET21. Αυξημένη συχνότητα ενεργοποίησης ανιχνεύθηκε στο SAM του nlsGPS1 που υποβλήθηκε σε αγωγή με 10 μM GA4+7 για 100 λεπτά (Συμπληρωματικό Σχήμα 9a-e), υποδεικνύοντας ότι το nlsGPS1 ανταποκρίνεται στις αλλαγές στη συγκέντρωση GA στο SAM, όπως συμβαίνει και στις ρίζες21. Η χωρική κατανομή της συχνότητας ενεργοποίησης του nlsGPS1 αποκάλυψε σχετικά χαμηλά επίπεδα GA στα εξωτερικά στρώματα του SAM, αλλά έδειξε ότι ήταν αυξημένα στο κέντρο και στα όρια του SAM (Σχήμα 4e και Συμπληρωματικό Σχήμα 9a,c). Αυτό υποδηλώνει ότι το GA κατανέμεται επίσης στο SAM με ένα χωρικό πρότυπο συγκρίσιμο με αυτό που αποκαλύπτεται από το qmRGA. Ως συμπληρωματική προσέγγιση, αντιμετωπίσαμε επίσης το SAM με φθορίζον GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ή μόνο Fl ως αρνητικό έλεγχο. Το σήμα Fl κατανεμήθηκε σε όλο το SAM, συμπεριλαμβανομένης της κεντρικής περιοχής και του αρχέγονου, αν και σε χαμηλότερη ένταση (Εικόνα 4j και Συμπληρωματικό Σχήμα 10d). Αντίθετα, και τα τρία GA-Fl συσσωρεύτηκαν ειδικά εντός των ορίων του αρχέγονου και σε ποικίλους βαθμούς στο υπόλοιπο IPR, με το GA7-Fl να συσσωρεύεται στον μεγαλύτερο τομέα του IPR (Εικόνα 4k και Συμπληρωματικό Σχήμα 10a,b). Η ποσοτικοποίηση της έντασης φθορισμού αποκάλυψε ότι ο λόγος έντασης IPR προς μη-IPR ήταν υψηλότερος στο SAM που υποβλήθηκε σε αγωγή με GA-Fl σε σύγκριση με το SAM που υποβλήθηκε σε αγωγή με Fl (Εικόνα 4l και Συμπληρωματικό Σχήμα 10c). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι το GA υπάρχει σε υψηλότερες συγκεντρώσεις σε κύτταρα IPR που βρίσκονται πλησιέστερα στα όρια του οργάνου. Αυτό υποδηλώνει ότι το πρότυπο της δραστηριότητας σηματοδότησης SAM GA προκύπτει τόσο από τη διαφορική έκφραση των υποδοχέων GA όσο και από τη διαφορική συσσώρευση GA σε κύτταρα IPR κοντά στα όρια των οργάνων. Έτσι, η ανάλυσή μας αποκάλυψε ένα απροσδόκητο χωροχρονικό πρότυπο σηματοδότησης GA, με χαμηλότερη δραστηριότητα στο κέντρο και το πρωτεύον τμήμα του SAM και υψηλότερη δραστηριότητα στο IPR στην περιφερειακή περιοχή.
Για να κατανοήσουμε τον ρόλο της διαφορικής δραστηριότητας σηματοδότησης GA στο SAM, αναλύσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA, της κυτταρικής επέκτασης και της κυτταρικής διαίρεσης χρησιμοποιώντας απεικόνιση σε πραγματικό χρόνο του SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. Δεδομένου του ρόλου του GA στη ρύθμιση της ανάπτυξης, αναμενόταν θετική συσχέτιση με τις παραμέτρους κυτταρικής επέκτασης. Επομένως, συγκρίναμε πρώτα τους χάρτες δραστηριότητας σηματοδότησης GA με χάρτες του ρυθμού ανάπτυξης της κυτταρικής επιφάνειας (ως υποκατάστατο για την ισχύ της κυτταρικής επέκτασης για ένα δεδομένο κύτταρο και για τα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διαίρεση) και με χάρτες ανισοτροπίας ανάπτυξης, η οποία μετρά την κατευθυντικότητα της κυτταρικής επέκτασης (που χρησιμοποιείται επίσης εδώ για ένα δεδομένο κύτταρο και για τα θυγατρικά κύτταρα κατά τη διαίρεση· Σχήμα 5α,β, βλέπε Μέθοδοι και Συμπληρωματικές Μέθοδοι). Οι χάρτες μας του ρυθμού ανάπτυξης της κυτταρικής επιφάνειας SAM είναι σύμφωνοι με προηγούμενες παρατηρήσεις38,39, με ελάχιστους ρυθμούς ανάπτυξης στο όριο και μέγιστους ρυθμούς ανάπτυξης στα αναπτυσσόμενα άνθη (Σχήμα 5α). Η ανάλυση κύριων συνιστωσών (PCA) έδειξε ότι η δραστηριότητα σηματοδότησης GA συσχετίστηκε αρνητικά με την ένταση ανάπτυξης της κυτταρικής επιφάνειας (Σχήμα 5γ). Δείξαμε επίσης ότι οι κύριοι άξονες μεταβολής, συμπεριλαμβανομένης της εισόδου σηματοδότησης GA και της έντασης ανάπτυξης, ήταν ορθογώνιοι προς την κατεύθυνση που καθορίστηκε από την υψηλή έκφραση CLV3, επιβεβαιώνοντας τον αποκλεισμό κυττάρων από το κέντρο SAM στις υπόλοιπες αναλύσεις. Η ανάλυση συσχέτισης Spearman επιβεβαίωσε τα αποτελέσματα PCA (Σχήμα 5δ), υποδεικνύοντας ότι τα υψηλότερα σήματα GA στο IPR δεν οδήγησαν σε υψηλότερη κυτταρική επέκταση. Ωστόσο, η ανάλυση συσχέτισης αποκάλυψε μια ελαφρώς θετική συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (Σχήμα 5γ, δ), υποδηλώνοντας ότι η υψηλότερη σηματοδότηση GA στο IPR επηρεάζει την κατεύθυνση της κυτταρικής ανάπτυξης και πιθανώς τη θέση του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης.
α, β Οι χάρτες θερμότητας της μέσης επιφανειακής ανάπτυξης (α) και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (β) σε SAM υπολογίστηκαν κατά μέσο όρο σε επτά ανεξάρτητα φυτά (χρησιμοποιήθηκαν ως υποκατάστατα για την ισχύ και την κατεύθυνση της κυτταρικής επέκτασης, αντίστοιχα). γ Η ανάλυση PCA περιελάμβανε τις ακόλουθες μεταβλητές: σήμα GA, ένταση επιφανειακής ανάπτυξης, ανισοτροπία επιφανειακής ανάπτυξης και έκφραση CLV3. Το συστατικό PCA 1 συσχετίστηκε κυρίως αρνητικά με την ένταση επιφανειακής ανάπτυξης και συσχετίστηκε θετικά με το σήμα GA. Το συστατικό PCA 2 συσχετίστηκε κυρίως θετικά με την ανισοτροπία επιφανειακής ανάπτυξης και συσχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση CLV3. Τα ποσοστά αντιπροσωπεύουν την απόκλιση που εξηγείται από κάθε συστατικό. δ Ανάλυση συσχέτισης Spearman μεταξύ σήματος GA, έντασης επιφανειακής ανάπτυξης και ανισοτροπίας επιφανειακής ανάπτυξης στην κλίμακα ιστού εξαιρουμένου του CZ. Ο αριθμός στα δεξιά είναι η τιμή Spearman rho μεταξύ δύο μεταβλητών. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν περιπτώσεις όπου η συσχέτιση/αρνητική συσχέτιση είναι ιδιαίτερα σημαντική. ε Τρισδιάστατη απεικόνιση κυττάρων Col-0 SAM L1 με ομοεστιακή μικροσκοπία. Τα νέα κυτταρικά τοιχώματα που σχηματίστηκαν στο SAM (αλλά όχι στο primordium) στις 10 ώρες χρωματίζονται σύμφωνα με τις τιμές γωνίας τους. Η χρωματική γραμμή εμφανίζεται στην κάτω δεξιά γωνία. Το ένθετο δείχνει την αντίστοιχη τρισδιάστατη εικόνα στις 0 ώρες. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. f Τα διαγράμματα κουτιών εμφανίζουν τους ρυθμούς κυτταρικής διαίρεσης σε IPR και μη-IPR Col-0 SAM (n = 10 ανεξάρτητα φυτά). Η κεντρική γραμμή δείχνει τη διάμεση τιμή και τα όρια του κουτιού υποδεικνύουν το 25ο και 75ο εκατοστημόριο. Τα μουστάκια υποδεικνύουν τις ελάχιστες και μέγιστες τιμές που προσδιορίστηκαν με το λογισμικό R. Οι τιμές P ελήφθησαν με το t-test δύο ουρών του Welch. g, h Σχηματικό διάγραμμα που δείχνει (g) πώς να μετρήσετε τη γωνία του νέου κυτταρικού τοιχώματος (ματζέντα) σε σχέση με την ακτινική κατεύθυνση από το κέντρο του SAM (λευκή διακεκομμένη γραμμή) (λαμβάνονται υπόψη μόνο οι τιμές οξείας γωνίας, δηλαδή 0–90°) και (h) τις περιφερειακές/πλάγιες και ακτινικές κατευθύνσεις εντός του μεριστώματος. Ιστογράμματα συχνότητας προσανατολισμού του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης κατά μήκος του SAM (σκούρο μπλε), του IPR (μεσαίο μπλε) και του μη-IPR (ανοιχτό μπλε), αντίστοιχα. Οι τιμές P ελήφθησαν με αμφίπλευρη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. j Ιστογράμματα συχνότητας προσανατολισμού του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης του IPR γύρω από το P3 (ανοιχτό πράσινο), το P4 (μεσαίο πράσινο) και το P5 (σκούρο πράσινο), αντίστοιχα. Οι τιμές P ελήφθησαν με αμφίπλευρη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα.
Επομένως, στη συνέχεια διερευνήσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της σηματοδότησης GA και της δραστηριότητας κυτταρικής διαίρεσης, εντοπίζοντας νεοσχηματισμένα κυτταρικά τοιχώματα κατά τη διάρκεια της δοκιμασίας (Εικ. 5ε). Αυτή η προσέγγιση μας επέτρεψε να μετρήσουμε τη συχνότητα και την κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης. Παραδόξως, διαπιστώσαμε ότι η συχνότητα των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR και στο υπόλοιπο SAM (μη-IPR, Εικ. 5στ) ήταν παρόμοια, υποδεικνύοντας ότι οι διαφορές στην σηματοδότηση GA μεταξύ των κυττάρων IPR και μη-IPR δεν επηρεάζουν σημαντικά την κυτταρική διαίρεση. Αυτό, και η θετική συσχέτιση μεταξύ της σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης, μας ώθησαν να εξετάσουμε εάν η δραστηριότητα σηματοδότησης GA θα μπορούσε να επηρεάσει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης. Μετρήσαμε τον προσανατολισμό του νέου κυτταρικού τοιχώματος ως οξεία γωνία σε σχέση με τον ακτινικό άξονα που συνδέει το κέντρο του μεριστώματος και το κέντρο του νέου κυτταρικού τοιχώματος (Εικ. 5e-i) και παρατηρήσαμε μια σαφή τάση τα κύτταρα να διαιρούνται σε γωνίες κοντά στις 90° σε σχέση με τον ακτινικό άξονα, με τις υψηλότερες συχνότητες να παρατηρούνται στις 70-80° (23,28%) και 80-90° (22,62%) (Εικ. 5e,i), που αντιστοιχούν σε κυτταρικές διαιρέσεις στην περιφερειακή/εγκάρσια κατεύθυνση (Εικ. 5h). Για να εξετάσουμε τη συμβολή της σηματοδότησης GA σε αυτή τη συμπεριφορά κυτταρικής διαίρεσης, αναλύσαμε τις παραμέτρους κυτταρικής διαίρεσης στο IPR και στο μη-IPR ξεχωριστά (Εικ. 5i). Παρατηρήσαμε ότι η κατανομή της γωνίας διαίρεσης στα κύτταρα IPR διέφερε από αυτή στα κύτταρα μη-IPR ή στα κύτταρα σε ολόκληρο το SAM, με τα κύτταρα IPR να εμφανίζουν υψηλότερο ποσοστό πλευρικών/κυκλικών κυτταρικών διαιρέσεων, δηλαδή 70-80° και 80-90° (33,86% και 30,71%, αντίστοιχα, αντίστοιχες αναλογίες) (Εικ. 5i). Έτσι, οι παρατηρήσεις μας αποκάλυψαν μια συσχέτιση μεταξύ υψηλής σηματοδότησης GA και προσανατολισμού του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης κοντά στην περιφερειακή κατεύθυνση, παρόμοια με τη συσχέτιση μεταξύ της δραστηριότητας σηματοδότησης GA και της ανισοτροπίας ανάπτυξης (Εικ. 5c, d). Για να τεκμηριώσουμε περαιτέρω τη χωρική διατήρηση αυτής της συσχέτισης, μετρήσαμε τον προσανατολισμό του επιπέδου διαίρεσης στα κύτταρα IPR που περιβάλλουν το πρωτόγονο ξεκινώντας από το P3, καθώς η υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA ανιχνεύθηκε σε αυτήν την περιοχή ξεκινώντας από το P4 (Εικ. 4). Οι γωνίες διαίρεσης του IPR γύρω από τα P3 και P4 δεν έδειξαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, αν και παρατηρήθηκε αυξημένη συχνότητα πλευρικών κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR γύρω από το P4 (Εικ. 5j). Ωστόσο, στα κύτταρα IPR γύρω από το P5, η διαφορά στον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης έγινε στατιστικά σημαντική, με μια απότομη αύξηση στη συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων (Εικ. 5j). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση GA μπορεί να ελέγξει τον προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο SAM, κάτι που είναι σύμφωνο με προηγούμενες αναφορές40,41 ότι η υψηλή σηματοδότηση GA μπορεί να προκαλέσει πλευρικό προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR.
Προβλέπεται ότι τα κύτταρα στο IPR δεν θα ενσωματωθούν σε πρωτόγονα κύτταρα αλλά μάλλον σε μεσογονάτια κύτταρα2,42,43. Ο εγκάρσιος προσανατολισμός των κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR μπορεί να οδηγήσει στην τυπική οργάνωση παράλληλων διαμήκων σειρών επιδερμικών κυττάρων στα μεσογονάτια κύτταρα. Οι παρατηρήσεις μας που περιγράφονται παραπάνω υποδηλώνουν ότι η σηματοδότηση GA πιθανότατα παίζει ρόλο σε αυτή τη διαδικασία ρυθμίζοντας την κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης.
Η απώλεια της λειτουργίας αρκετών γονιδίων DELLA οδηγεί σε μια συστατική απόκριση GA, και οι μεταλλάξεις della μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση44. Αρχικά αναλύσαμε τα πρότυπα έκφρασης πέντε γονιδίων DELLA στο SAM. Η μεταγραφική σύντηξη της γραμμής GUS45 αποκάλυψε ότι τα GAI, RGA, RGL1 και RGL2 (σε πολύ μικρότερο βαθμό) εκφράστηκαν στο SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 11a-d). Ο υβριδισμός in situ έδειξε περαιτέρω ότι το mRNA του GAI συσσωρεύεται ειδικά σε πρωτόγονα και αναπτυσσόμενα άνθη (Συμπληρωματικό Σχήμα 11e). Το mRNA RGL1 και RGL3 ανιχνεύθηκε σε όλο το θόλο του SAM και σε παλαιότερα άνθη, ενώ το mRNA του RGL2 ήταν πιο άφθονο στην περιοχή των ορίων (Συμπληρωματικό Σχήμα 11f-h). Η ομοεστιακή απεικόνιση του pRGL3::RGL3-GFP SAM επιβεβαίωσε την έκφραση που παρατηρήθηκε με υβριδισμό in situ και έδειξε ότι η πρωτεΐνη RGL3 συσσωρεύεται στο κεντρικό τμήμα του SAM (Συμπληρωματικό Σχήμα 11i). Χρησιμοποιώντας τη γραμμή pRGA::GFP-RGA, διαπιστώσαμε επίσης ότι η πρωτεΐνη RGA συσσωρεύεται στο SAM, αλλά η αφθονία της μειώνεται στα όρια ξεκινώντας από το P4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 11j). Αξιοσημείωτα, τα πρότυπα έκφρασης των RGL3 και RGA είναι συμβατά με υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο IPR, όπως ανιχνεύεται από το qmRGA (Σχήμα 4). Επιπλέον, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι όλα τα DELLA εκφράζονται στο SAM και ότι η έκφρασή τους εκτείνεται συλλογικά σε ολόκληρο το SAM.
Στη συνέχεια αναλύσαμε τις παραμέτρους κυτταρικής διαίρεσης στο SAM άγριου τύπου (Ler, έλεγχος) και στα μεταλλαγμένα στελέχη gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) (Εικ. 6a, b). Είναι ενδιαφέρον ότι παρατηρήσαμε μια στατιστικά σημαντική μετατόπιση στην κατανομή των συχνοτήτων γωνίας κυτταρικής διαίρεσης στο μεταλλαγμένο SAM della global σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Εικ. 6c). Αυτή η αλλαγή στο μεταλλαγμένο γονίδιο della global οφειλόταν σε αύξηση της συχνότητας των γωνιών 80-90° (34,71% έναντι 24,55%) και, σε μικρότερο βαθμό, σε γωνίες 70-80° (23,78% έναντι 20,18%), δηλαδή, που αντιστοιχούν σε εγκάρσιες κυτταρικές διαιρέσεις (Εικ. 6c). Η συχνότητα των μη εγκάρσιων διαιρέσεων (0-60°) ήταν επίσης χαμηλότερη στο μεταλλαγμένο γονίδιο della global (Εικ. 6c). Η συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων αυξήθηκε σημαντικά στην SAM του μεταλλαγμένου della global (Εικ. 6b). Η συχνότητα των εγκάρσιων κυτταρικών διαιρέσεων στο IPR ήταν επίσης υψηλότερη στο μεταλλαγμένο della global σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Εικ. 6d). Εκτός της περιοχής IPR, ο άγριος τύπος είχε μια πιο ομοιόμορφη κατανομή των γωνιών κυτταρικής διαίρεσης, ενώ το μεταλλαγμένο della global προτίμησε εφαπτομενικές διαιρέσεις όπως το IPR (Εικ. 6e). Επίσης, ποσοτικοποιήσαμε τον προσανατολισμό των κυτταρικών διαιρέσεων στο SAM των πενταπλών μεταλλάξεων της οξειδάσης ga2 (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 και ga2ox6-2), ένα μεταλλαγμένο υπόβαθρο ανενεργού GA στο οποίο συσσωρεύεται GA. Σύμφωνα με την αύξηση των επιπέδων GA, η SAM της πενταπλής μεταλλαγμένης ταξιανθίας ga2ox ήταν μεγαλύτερη από αυτή του Col-0 (Συμπληρωματικό Σχήμα 12a, b), και σε σύγκριση με το Col-0, η πενταπλή ga2ox SAM έδειξε μια σαφώς διαφορετική κατανομή γωνιών κυτταρικής διαίρεσης, με τη συχνότητα γωνίας να αυξάνεται από 50° σε 90°, δηλαδή ευνοώντας και πάλι τις εφαπτομενικές διαιρέσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα 12a-c). Έτσι, δείχνουμε ότι η συστατική ενεργοποίηση της σηματοδότησης GA και η συσσώρευση GA προκαλούν πλευρικές κυτταρικές διαιρέσεις στο IPR και στο υπόλοιπο SAM.
a, b Τρισδιάστατη απεικόνιση της στρώσης L1 του χρωματισμένου με PI Ler (a) και του μεταλλαγμένου della (b) SAM χρησιμοποιώντας ομοεστιακή μικροσκοπία. Νέα κυτταρικά τοιχώματα που σχηματίστηκαν στο SAM (αλλά όχι στο primordium) σε διάστημα 10 ωρών εμφανίζονται και χρωματίζονται σύμφωνα με τις τιμές γωνίας τους. Το ένθετο δείχνει το SAM στις 0 ώρες. Η χρωματική γραμμή εμφανίζεται στην κάτω δεξιά γωνία. Το βέλος στο (b) δείχνει ένα παράδειγμα ευθυγραμμισμένων αρχείων κυττάρων στο μεταλλαγμένο della. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. ce σύγκριση της κατανομής συχνότητας των προσανατολισμών του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης σε ολόκληρο το SAM (d), IPR (e) και μη-IPR (f) μεταξύ Ler και ολικού della. Οι τιμές P ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια αμφίπλευρη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov. f, g Τρισδιάστατη απεικόνιση ομοεστιακών εικόνων χρωματισμένου με PI SAM των διαγονιδιακών φυτών Col-0 (i) και pCUC2::gai-1-VENUS (j). Τα πάνελ (a, b) δείχνουν νέα κυτταρικά τοιχώματα (αλλά όχι πρωτόγονα) που σχηματίστηκαν στο SAM εντός 10 ωρών. Το πείραμα επαναλήφθηκε δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. h–j Σύγκριση της κατανομής συχνότητας των προσανατολισμών του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης που βρίσκονται σε ολόκληρο το SAM (h), IPR (i) και μη-IPR (j) μεταξύ των φυτών Col-0 και pCUC2::gai-1-VENUS. Οι τιμές P ελήφθησαν χρησιμοποιώντας μια αμφίπλευρη δοκιμή Kolmogorov-Smirnov.
Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της αναστολής της σηματοδότησης GA ειδικά στο IPR. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε τον υποκινητή cotyledon cup 2 (CUC2) για να οδηγήσουμε την έκφραση μιας κυρίαρχης αρνητικής πρωτεΐνης gai-1 συγχωνευμένης με VENUS (στη σειρά pCUC2::gai-1-VENUS). Στο SAM άγριου τύπου, ο υποκινητής CUC2 οδηγεί την έκφραση των περισσότερων IPR στο SAM, συμπεριλαμβανομένων των οριακών κυττάρων, από το P4 και μετά, και παρόμοια ειδική έκφραση παρατηρήθηκε σε φυτά pCUC2::gai-1-VENUS (βλ. παρακάτω). Η κατανομή των γωνιών κυτταρικής διαίρεσης κατά μήκος του SAM ή του IPR των φυτών pCUC2::gai-1-VENUS δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από αυτή του άγριου τύπου, αν και απροσδόκητα διαπιστώσαμε ότι τα κύτταρα χωρίς IPR σε αυτά τα φυτά διαιρέθηκαν με υψηλότερη συχνότητα 80-90° (Εικ. 6f-j).
Έχει προταθεί ότι η κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης εξαρτάται από τη γεωμετρία του SAM, ιδιαίτερα από την τάση εφελκυσμού που δημιουργείται από την καμπυλότητα του ιστού46. Επομένως, ρωτήσαμε αν το σχήμα του SAM είχε μεταβληθεί στα φυτά della global mutant και pCUC2::gai-1-VENUS. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως12, το μέγεθος του della global mutant SAM ήταν μεγαλύτερο από αυτό του άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχήμα 13a, b, d). Η in situ υβριδοποίηση του CLV3 και του STM RNA επιβεβαίωσε την επέκταση του μεριστώματος στα μεταλλαγμένα della και περαιτέρω έδειξε την πλευρική επέκταση της θέσης των βλαστικών κυττάρων (Συμπληρωματικό Σχήμα 13e, f, h, i). Ωστόσο, η καμπυλότητα του SAM ήταν παρόμοια και στους δύο γονότυπους (Συμπληρωματικό Σχήμα 13k, m, n, p). Παρατηρήσαμε μια παρόμοια αύξηση μεγέθους στο τετραπλό μεταλλαγμένο gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della χωρίς αλλαγή στην καμπυλότητα σε σύγκριση με τον άγριο τύπο (Συμπληρωματικό Σχήμα 13c, d, g, j, l, o, p). Η συχνότητα του προσανατολισμού της κυτταρικής διαίρεσης επηρεάστηκε επίσης στο τετραπλό μεταλλαγμένο della, αλλά σε μικρότερο βαθμό από ό,τι στο μονολιθικό μεταλλαγμένο della (Συμπληρωματικό Σχήμα 12d-f). Αυτή η επίδραση δοσολογίας, μαζί με την έλλειψη επίδρασης στην καμπυλότητα, υποδηλώνει ότι η υπολειμματική δραστικότητα RGL3 στο τετραπλό μεταλλαγμένο Della περιορίζει τις αλλαγές στον προσανατολισμό της κυτταρικής διαίρεσης που προκαλούνται από την απώλεια της δραστικότητας DELLA και ότι οι αλλαγές στις πλευρικές κυτταρικές διαιρέσεις συμβαίνουν σε απόκριση σε αλλαγές στη δραστικότητα σηματοδότησης GA και όχι σε αλλαγές στη γεωμετρία SAM. Όπως περιγράφεται παραπάνω, ο υποκινητής CUC2 οδηγεί την έκφραση IPR στο SAM ξεκινώντας από το P4 (Συμπληρωματικό Σχήμα 14a, b), και αντίθετα, το pCUC2::gai-1-VENUS SAM είχε μειωμένο μέγεθος αλλά υψηλότερη καμπυλότητα (Συμπληρωματικό Σχήμα 14c-h). Αυτή η αλλαγή στη μορφολογία του pCUC2::gai-1-VENUS SAM μπορεί να οδηγήσει σε διαφορετική κατανομή μηχανικών τάσεων σε σύγκριση με τον άγριο τύπο, στον οποίο οι υψηλές περιφερειακές τάσεις ξεκινούν σε μικρότερη απόσταση από το κέντρο του SAM47. Εναλλακτικά, οι αλλαγές στη μορφολογία του pCUC2::gai-1-VENUS SAM μπορεί να προκύψουν από αλλαγές στις περιφερειακές μηχανικές ιδιότητες που προκαλούνται από την έκφραση τρανσγονιδίων48. Και στις δύο περιπτώσεις, αυτό θα μπορούσε να αντισταθμίσει εν μέρει τις επιπτώσεις των αλλαγών στην σηματοδότηση GA αυξάνοντας την πιθανότητα τα κύτταρα να διαιρεθούν στον περιφερειακό/εγκάρσιο προσανατολισμό, εξηγώντας τις παρατηρήσεις μας.
Συνολικά, τα δεδομένα μας επιβεβαιώνουν ότι η υψηλότερη σηματοδότηση GA παίζει ενεργό ρόλο στον πλευρικό προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης στο IPR. Δείχνουν επίσης ότι η καμπυλότητα του μεριστώματος επηρεάζει επίσης τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης στο IPR.
Ο εγκάρσιος προσανατολισμός του επιπέδου διαίρεσης στο IPR, λόγω της υψηλής δραστηριότητας σηματοδότησης GA, υποδηλώνει ότι το GA προ-οργανώνει ένα ακτινικό αρχείο κυττάρων στην επιδερμίδα εντός του SAM για να ορίσει την κυτταρική οργάνωση που αργότερα θα βρεθεί στον επιδερμικό μεσοκόμματο. Πράγματι, τέτοια αρχεία κυττάρων ήταν συχνά ορατά σε εικόνες SAM των μεταλλαγμένων della global (Εικ. 6b). Έτσι, για να διερευνήσουμε περαιτέρω την αναπτυξιακή λειτουργία του χωρικού προτύπου της σηματοδότησης GA στο SAM, χρησιμοποιήσαμε απεικόνιση με χρονική καθυστέρηση για να αναλύσουμε την χωρική οργάνωση των κυττάρων στο IPR σε άγριου τύπου (Ler και Col-0), μεταλλαγμένα della global και διαγονιδιακά φυτά pCUC2::gai-1-VENUS.
Διαπιστώσαμε ότι το qmRGA έδειξε ότι η δραστηριότητα σηματοδότησης GA στο IPR αυξήθηκε από P1/P2 και κορυφώθηκε στο P4, και αυτό το μοτίβο παρέμεινε σταθερό με την πάροδο του χρόνου (Εικόνα 4a-f και Συμπληρωματικό Σχήμα 8c-f, k). Για να αναλύσουμε την χωρική οργάνωση των κυττάρων στο IPR με αυξανόμενο σήμα GA, επισημάναμε τα κύτταρα Ler IPR πάνω και στις πλευρές του P4 σύμφωνα με την αναπτυξιακή τους μοίρα που αναλύθηκε 34 ώρες μετά την πρώτη παρατήρηση, δηλαδή, περισσότερες από δύο φορές πλαστίδιο, επιτρέποντάς μας να παρακολουθήσουμε τα κύτταρα IPR κατά την ανάπτυξη του πρωταρχικού στοιχείου από το P1/P2 στο P4. Χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά χρώματα: κίτρινο για εκείνα τα κύτταρα που ενσωματώθηκαν στο πρωταρχικό στοιχείο κοντά στο P4, πράσινο για εκείνα που βρίσκονταν στο IPR και μοβ για εκείνα που συμμετείχαν και στις δύο διεργασίες (Εικόνα 7a-c). Στο t0 (0 h), 1-2 στρώματα κυττάρων IPR ήταν ορατά μπροστά από το P4 (Εικόνα 7a). Όπως αναμενόταν, όταν αυτά τα κύτταρα διαιρέθηκαν, το έκαναν κυρίως μέσω του εγκάρσιου επιπέδου διαίρεσης (Εικ. 7a–c). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν χρησιμοποιώντας Col-0 SAM (με επίκεντρο το P3, του οποίου το όριο αναδιπλώνεται παρόμοια με το P4 στο Ler), αν και σε αυτόν τον γονότυπο η πτυχή που σχηματίστηκε στο ανθικό όριο έκρυψε τα κύτταρα IPR πιο γρήγορα (Εικ. 7g–i). Έτσι, το πρότυπο διαίρεσης των κυττάρων IPR προ-οργανώνει τα κύτταρα σε ακτινικές σειρές, όπως στους μεσογονάτιους κόμβους. Η οργάνωση των ακτινικών σειρών και ο εντοπισμός των κυττάρων IPR μεταξύ διαδοχικών οργάνων υποδηλώνουν ότι αυτά τα κύτταρα είναι μεσογονάτιοι πρόγονοι.
Εδώ, αναπτύξαμε έναν αναλογιομετρικό βιοαισθητήρα σηματοδότησης GA, qmRGA, που επιτρέπει την ποσοτική χαρτογράφηση της δραστηριότητας σηματοδότησης GA που προκύπτει από τον συνδυασμό συγκεντρώσεων GA και υποδοχέα GA, ελαχιστοποιώντας παράλληλα την παρεμβολή με ενδογενείς οδούς σηματοδότησης, παρέχοντας έτσι πληροφορίες για τη λειτουργία του GA σε κυτταρικό επίπεδο. Για το σκοπό αυτό, κατασκευάσαμε μια τροποποιημένη πρωτεΐνη DELLA, mRGA, η οποία έχει χάσει την ικανότητα να συνδέεται με τους εταίρους αλληλεπίδρασης DELLA, αλλά παραμένει ευαίσθητη στην πρωτεόλυση που προκαλείται από GA. Το qmRGA ανταποκρίνεται τόσο σε εξωγενείς όσο και σε ενδογενείς αλλαγές στα επίπεδα GA, και οι δυναμικές ιδιότητες ανίχνευσης επιτρέπουν την αξιολόγηση των χωροχρονικών αλλαγών στη δραστηριότητα σηματοδότησης GA κατά την ανάπτυξη. Το qmRGA είναι επίσης ένα πολύ ευέλικτο εργαλείο, καθώς μπορεί να προσαρμοστεί σε διαφορετικούς ιστούς αλλάζοντας τον υποκινητή που χρησιμοποιείται για την έκφρασή του (εάν είναι απαραίτητο), και δεδομένης της διατηρημένης φύσης της οδού σηματοδότησης GA και του μοτίβου PFYRE σε όλα τα αγγειόσπερμα, είναι πιθανό να είναι μεταβιβάσιμο σε άλλα είδη22. Σύμφωνα με αυτό, μια ισοδύναμη μετάλλαξη στην πρωτεΐνη SLR1 DELLA του ρυζιού (HYY497AAA) έδειξε επίσης ότι καταστέλλει την δραστικότητα καταστολής ανάπτυξης της SLR1, ενώ μειώνει μόνο ελαφρώς την αποικοδόμηση που προκαλείται από το GA, παρόμοια με το mRGA23. Αξιοσημείωτα, πρόσφατες μελέτες στο Arabidopsis έδειξαν ότι μια μεμονωμένη μετάλλαξη αμινοξέος στην περιοχή PFYRE (S474L) άλλαξε τη μεταγραφική δραστικότητα του RGA χωρίς να επηρεάσει την ικανότητά του να αλληλεπιδρά με τους εταίρους του μεταγραφικού παράγοντα50. Αν και αυτή η μετάλλαξη είναι πολύ κοντά στις 3 υποκαταστάσεις αμινοξέων που υπάρχουν στο mRGA, οι μελέτες μας δείχνουν ότι αυτές οι δύο μεταλλάξεις αλλοιώνουν τα διακριτά χαρακτηριστικά του DELLA. Αν και οι περισσότεροι εταίροι του μεταγραφικού παράγοντα συνδέονται με τις περιοχές LHR1 και SAW του DELLA26,51, ορισμένα διατηρημένα αμινοξέα στην περιοχή PFYRE μπορούν να βοηθήσουν στη σταθεροποίηση αυτών των αλληλεπιδράσεων.
Η ανάπτυξη των μεσογονατίδων είναι ένα βασικό χαρακτηριστικό στην αρχιτεκτονική των φυτών και στη βελτίωση της απόδοσης. Η qmRGA αποκάλυψε υψηλότερη δραστηριότητα σηματοδότησης GA σε προγονικά κύτταρα μεσογονατίδων IPR. Συνδυάζοντας ποσοτική απεικόνιση και γενετική, δείξαμε ότι τα πρότυπα σηματοδότησης GA υπερθέτουν κυκλικά/εγκάρσια επίπεδα κυτταρικής διαίρεσης στην επιδερμίδα SAM, διαμορφώνοντας την οργάνωση κυτταρικής διαίρεσης που απαιτείται για την ανάπτυξη των μεσογονατίδων. Αρκετοί ρυθμιστές του προσανατολισμού του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης έχουν εντοπιστεί κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης52,53. Η εργασία μας παρέχει ένα σαφές παράδειγμα του πώς η δραστηριότητα σηματοδότησης GA ρυθμίζει αυτήν την κυτταρική παράμετρο. Το DELLA μπορεί να αλληλεπιδράσει με προ-αναδιπλούμενα πρωτεϊνικά σύμπλοκα41, επομένως η σηματοδότηση GA μπορεί να ρυθμίζει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης επηρεάζοντας άμεσα τον προσανατολισμό των μικροσωληνίσκων του φλοιού40,41,54,55. Απροσδόκητα δείξαμε ότι στο SAM, η συσχέτιση της υψηλότερης δραστηριότητας σηματοδότησης GA δεν ήταν η επιμήκυνση ή η διαίρεση των κυττάρων, αλλά μόνο η ανισοτροπία ανάπτυξης, η οποία είναι συνεπής με την άμεση επίδραση του GA στην κατεύθυνση της κυτταρικής διαίρεσης στο IPR. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι αυτή η επίδραση θα μπορούσε επίσης να είναι έμμεση, για παράδειγμα μεσολαβούμενη από την επαγόμενη από το GA μαλάκυνση του κυτταρικού τοιχώματος56. Οι αλλαγές στις ιδιότητες του κυτταρικού τοιχώματος προκαλούν μηχανική καταπόνηση57,58, η οποία μπορεί επίσης να επηρεάσει τον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης επηρεάζοντας τον προσανατολισμό των φλοιωδών μικροσωληνίσκων39,46,59. Οι συνδυασμένες επιδράσεις της επαγόμενης από το GA μηχανικής καταπόνησης και της άμεσης ρύθμισης του προσανατολισμού των μικροσωληνίσκων από το GA μπορεί να εμπλέκονται στη δημιουργία ενός συγκεκριμένου προτύπου προσανατολισμού κυτταρικής διαίρεσης στο IPR για τον ορισμό των μεσογονατίων, και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να δοκιμαστεί αυτή η ιδέα. Ομοίως, προηγούμενες μελέτες έχουν επισημάνει τη σημασία των πρωτεϊνών TCP14 και 15 που αλληλεπιδρούν με το DELLA στον έλεγχο του σχηματισμού των μεσογονατίων60,61 και αυτοί οι παράγοντες μπορεί να μεσολαβούν στη δράση του GA μαζί με τα BREVIPEDICELLUS (BP) και PENNYWISE (PNY), τα οποία ρυθμίζουν την ανάπτυξη των μεσογονατίων και έχουν αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τη σηματοδότηση του GA2,62. Δεδομένου ότι τα DELLA αλληλεπιδρούν με σηματοδοτικές οδούς brassinosteroid, αιθυλενίου, ιασμονικού οξέος και αμπσισικού οξέος (ABA)63,64 και ότι αυτές οι ορμόνες μπορούν να επηρεάσουν τον προσανατολισμό των μικροσωληνίσκων65, οι επιδράσεις του GA στον προσανατολισμό της κυτταρικής διαίρεσης μπορεί επίσης να προκαλούνται από άλλες ορμόνες.
Πρώιμες κυτταρολογικές μελέτες έδειξαν ότι τόσο η εσωτερική όσο και η εξωτερική περιοχή του SAM του Arabidopsis είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη των μεσογονατίων2,42. Το γεγονός ότι το GA ρυθμίζει ενεργά την κυτταρική διαίρεση στους εσωτερικούς ιστούς12 υποστηρίζει μια διπλή λειτουργία του GA στη ρύθμιση του μεριστώματος και του μεγέθους των μεσογονατίων στο SAM. Το πρότυπο της κατευθυνόμενης κυτταρικής διαίρεσης ρυθμίζεται επίσης αυστηρά στον εσωτερικό ιστό SAM και αυτή η ρύθμιση είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη του στελέχους52. Θα είναι ενδιαφέρον να εξεταστεί εάν το GA παίζει επίσης ρόλο στον προσανατολισμό του επιπέδου κυτταρικής διαίρεσης στην εσωτερική οργάνωση του SAM, συγχρονίζοντας έτσι τον καθορισμό και την ανάπτυξη των μεσογονατίων εντός του SAM.
Τα φυτά αναπτύχθηκαν in vitro σε έδαφος ή σε 1x μέσο Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) συμπληρωμένο με 1% σακχαρόζη και 1% άγαρ (Sigma) υπό τυπικές συνθήκες (16 ώρες φωτός, 22 °C), εκτός από τα πειράματα υποκοτυλίου και ανάπτυξης ριζών στα οποία τα σπορόφυτα αναπτύχθηκαν σε κάθετες πλάκες υπό σταθερό φως και 22 °C. Για τα πειράματα νιτρικών, τα φυτά αναπτύχθηκαν σε τροποποιημένο μέσο MS (bioWORLD plant medium) συμπληρωμένο με επαρκές νιτρικό (0 ή 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-ηλεκτρικό, 1% σακχαρόζη και 1% Α-άγαρ (Sigma) υπό συνθήκες μεγάλης ημέρας.
Το cDNA GID1a που εισήχθη στο pDONR221 ανασυνδυάστηκε με το pDONR P4-P1R-pUBQ10 και το pDONR P2R-P3-mCherry στο pB7m34GW για να δημιουργηθεί το pUBQ10::GID1a-mCherry. Το DNA IDD2 που εισήχθη στο pDONR221 ανασυνδυάστηκε στο pB7RWG266 για να δημιουργηθεί το p35S:IDD2-RFP. Για τη δημιουργία του pGID1b::2xmTQ2-GID1b, ένα θραύσμα 3,9 kb ανοδικά της κωδικοποιητικής περιοχής GID1b και ένα θραύσμα 4,7 kb που περιείχε το cDNA GID1b (1,3 kb) και τον τερματιστή (3,4 kb) ενισχύθηκαν πρώτα χρησιμοποιώντας τους εκκινητές στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 και στη συνέχεια εισήχθησαν σε pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) και pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), αντίστοιχα, και τέλος ανασυνδυάστηκαν με pDONR221 2xmTQ268 στον φορέα-στόχο pGreen 012567 χρησιμοποιώντας κλωνοποίηση Gateway. Για τη δημιουργία του pCUC2::LSSmOrange, η αλληλουχία υποκινητή CUC2 (3229 bp ανοδικά του ATG) ακολουθούμενη από την κωδικοποιητική αλληλουχία του μεγάλου mOrange με μετατόπιση Stokes (LSSmOrange)69 με το σήμα πυρηνικής εντόπισης N7 και τον μεταγραφικό τερματιστή NOS συναρμολογήθηκαν στον φορέα στόχευσης καναμυκίνης pGreen χρησιμοποιώντας το σύστημα ανασυνδυασμού θραυσμάτων Gateway 3 (Invitrogen). Ο δυαδικός φορέας φυτού εισήχθη στο στέλεχος GV3101 του Agrobacterium tumefaciens και εισήχθη στα φύλλα Nicotiana benthamiana με τη μέθοδο διήθησης Agrobacterium και στο Arabidopsis thaliana Col-0 με τη μέθοδο εμβάπτισης λουλουδιών, αντίστοιχα. pUBQ10::qmRGA Τα pUBQ10::GID1a-mCherry και pCLV3::mCherry-NLS qmRGA απομονώθηκαν από τους απογόνους F3 και F1 των αντίστοιχων διασταυρώσεων, αντίστοιχα.
Η υβριδοποίηση RNA in situ πραγματοποιήθηκε σε άκρες βλαστών μήκους περίπου 1 cm72, οι οποίες συλλέχθηκαν και σταθεροποιήθηκαν αμέσως σε διάλυμα FAA (3,7% φορμαλδεΰδη, 5% οξικό οξύ, 50% αιθανόλη) προψυγμένο στους 4 °C. Μετά από 2 × 15 λεπτά κατεργασίας κενού, το σταθεροποιητικό άλλαξε και τα δείγματα επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Τα cDNA GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 και RGL3 και οι αντιπληροφοριακοί ανιχνευτές στα 3'-UTR τους συντέθηκαν χρησιμοποιώντας τους εκκινητές που φαίνονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3 όπως περιγράφεται από τους Rosier et al.73. Οι ανιχνευτές που ήταν σημασμένοι με διγοξιγενίνη ανοσοανιχνεύτηκαν χρησιμοποιώντας αντισώματα διγοξιγενίνης (αραίωση 3000 φορές· Roche, αριθμός καταλόγου: 11 093 274 910) και οι τομές χρωματίστηκαν με διάλυμα 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλοφωσφορικού (BCIP, αραίωση 250 φορές)/νιτρομπλε τετραζολίου (NBT, αραίωση 200 φορές).
Ώρα δημοσίευσης: 10 Φεβρουαρίου 2025