Οι πρωτεΐνες DELLA διατηρούνταιρυθμιστές ανάπτυξηςπου παίζουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των φυτών ως απόκριση σε εσωτερικά και εξωτερικά σήματα. Ως μεταγραφικοί ρυθμιστές, τα DELLA συνδέονται με μεταγραφικούς παράγοντες (TFs) και ιστόνη H2A μέσω των τομέων GRAS τους και στρατολογούνται για να δράσουν στους προαγωγείς. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η σταθερότητα του DELLA ρυθμίζεται μετα-μεταφραστικά από δύο μηχανισμούς: την πολυουβικουϊτινοποίηση που προκαλείται από τη φυτική ορμόνηγιββερελίνη, που οδηγεί σε ταχεία αποικοδόμησή τους και σύζευξη με μικρό τροποποιητή τύπου ουβικιτίνης (SUMO), που αυξάνει τη συσσώρευσή τους. Επιπλέον, η δραστηριότητα της DELLA ρυθμίζεται δυναμικά από δύο διακριτούς μηχανισμούς γλυκοζυλίωσης: Η Ο-φουκοζυλίωση ενισχύει την αλληλεπίδραση DELLA-TF, ενώ η τροποποίηση Ο-συνδεδεμένης Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης (O-GlcNAc) αναστέλλει την αλληλεπίδραση DELLA-TF. Ωστόσο, ο ρόλος της φωσφορυλίωσης DELLA είναι ασαφής καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα, με ορισμένες να υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση προάγει ή καταστέλλει την αποικοδόμηση της DELLA και άλλες να υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση δεν επηρεάζει τη σταθερότητά τους. Εδώ, προσδιορίζουμε θέσεις φωσφορυλίωσης στον καταστολέα GA1-3 (RGA), AtDELLA, που καθαρίστηκε από Arabidopsis thaliana με φασματομετρία μάζας και δείχνουμε ότι η φωσφορυλίωση δύο πεπτιδίων RGA στις περιοχές PolyS και PolyS/T ενισχύει τη δραστηριότητα RGA προάγοντας τη δέσμευση H2A και τη σύνδεση RGA με προαγωγούς στόχους. Συγκεκριμένα, η φωσφορυλίωση δεν επηρέασε τις αλληλεπιδράσεις RGA-TF ή τη σταθερότητα του RGA. Η μελέτη μας αποκαλύπτει έναν μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου η φωσφορυλίωση προκαλεί δραστηριότητα DELLA.
Η φασματομετρική μας ανάλυση μάζας αποκάλυψε ότι τόσο το Pep1 όσο και το Pep2 ήταν πολύ φωσφορυλιωμένα σε RGA στο υπόβαθρο Ga1 με ανεπάρκεια GA. Εκτός από αυτή τη μελέτη, φωσφοπρωτεωμικές μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει φωσφορυλίωση Pep1 σε RGA, αν και ο ρόλος της δεν έχει ακόμη μελετηθεί53,54,55. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση Pep2 δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως αφού αυτό το πεπτίδιο μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο χρησιμοποιώντας το διαγονίδιο RGAGKG. Αν και η μετάλλαξη m1A, η οποία κατάργησε τη φωσφορυλίωση Pep1, μείωσε ελαφρώς τη δραστηριότητα RGA στο φυτό, είχε αθροιστική επίδραση όταν συνδυάστηκε με m2A στη μείωση της δραστηριότητας RGA (Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Είναι σημαντικό ότι η φωσφορυλίωση Pep1 μειώθηκε σημαντικά στο μετάλλαγμα sly1 ενισχυμένο με GA σε σύγκριση με το ga1, υποδηλώνοντας ότι το GA προάγει την αποφωσφορυλίωση RGA, μειώνοντας τη δραστηριότητά του. Ο μηχανισμός με τον οποίο το GA καταστέλλει τη φωσφορυλίωση RGA απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Μια πιθανότητα είναι ότι αυτό επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης μιας μη αναγνωρισμένης πρωτεϊνικής κινάσης. Παρόλο που μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση της κινάσης πρωτεΐνης CK1 EL1 ρυθμίζεται προς τα κάτω από το GA στο ρύζι41, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι υψηλότερης τάξης μεταλλάξεις του ομολόγου Arabidopsis EL1 (AEL1-4) δεν μειώνουν τη φωσφορυλίωση RGA. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματά μας, μια πρόσφατη φωσφοπρωτεωμική μελέτη που χρησιμοποιεί γραμμές υπερέκφρασης Arabidopsis AEL και τριπλό μετάλλαγμα ael δεν εντόπισε καμία πρωτεΐνη DELLA ως υποστρώματα αυτών των κινασών56. Όταν ετοιμάσαμε το χειρόγραφο, αναφέρθηκε ότι το GSK3, το γονίδιο που κωδικοποιεί μια κινάση παρόμοια με GSK3/SHAGGY στο σιτάρι (Triticum aestivum), μπορεί να φωσφορυλώσει το DELLA (Rht-B1b)57, αν και η φωσφορυλίωση του Rht-B1b από το φυτό GSK3 δεν έχει επιβεβαιωθεί. Οι in vitro ενζυματικές αντιδράσεις παρουσία GSK3 που ακολουθήθηκαν από ανάλυση φασματομετρίας μάζας αποκάλυψαν τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης που βρίσκονται μεταξύ των περιοχών DELLA και GRAS του Rht-B1b (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Οι υποκαταστάσεις σερίνης σε αλανίνη και στις τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης είχαν ως αποτέλεσμα μειωμένη δραστηριότητα Rht-B1b στο διαγονιδιακό σιτάρι, σύμφωνα με τα ευρήματά μας ότι οι υποκαταστάσεις αλανίνης στο Pep2 RGA μείωσαν τη δραστηριότητα RGA. Ωστόσο, in vitro δοκιμές αποικοδόμησης πρωτεΐνης έδειξαν περαιτέρω ότι η φωσφορυλίωση μπορεί επίσης να σταθεροποιήσει το Rht-B1b57. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας που δείχνουν ότι οι υποκαταστάσεις αλανίνης στο Pep2 RGA δεν αλλάζουν τη σταθερότητά του στο φυτό. Το GSK3 στο σιτάρι είναι ένα ορθολόγιο της μη ευαίσθητης σε βρασινοστεροειδή πρωτεΐνη 2 (BIN2) στο Arabidopsis 57. Το BIN2 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης BR και το BR ενεργοποιεί τη οδό σηματοδοσίας του προκαλώντας υποβάθμιση του BIN2. (Συμπληρωματικό Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι το RGA είναι απίθανο να φωσφορυλιωθεί από το BIN2.
Όλα τα ποσοτικά δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το Excel και προσδιορίστηκαν σημαντικές διαφορές χρησιμοποιώντας το Student's t-test. Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαθορισμό του μεγέθους του δείγματος. Δεν εξαιρέθηκαν δεδομένα από την ανάλυση. το πείραμα δεν ήταν τυχαιοποιημένο. και οι ερευνητές γνώριζαν την κατανομή κατά τη διάρκεια του πειράματος και της αξιολόγησης των αποτελεσμάτων. Τα μεγέθη των δειγμάτων παρέχονται στα υπόμνημα του σχήματος και στα αρχεία ακατέργαστων δεδομένων.
Ώρα δημοσίευσης: Απρ-15-2025