Οι πρωτεΐνες DELLA είναι συντηρημένεςρυθμιστές ανάπτυξηςπου παίζουν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη των φυτών σε απόκριση σε εσωτερικά και εξωτερικά σήματα. Ως ρυθμιστές μεταγραφής, τα DELLA συνδέονται με παράγοντες μεταγραφής (TFs) και ιστόνη H2A μέσω των GRAS περιοχών τους και στρατολογούνται για να δράσουν στους υποκινητές. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η σταθερότητα των DELLA ρυθμίζεται μετα-μεταφραστικά από δύο μηχανισμούς: την πολυουβικιτίνη που προκαλείται από την φυτική ορμόνη.γιβερελίνη, γεγονός που οδηγεί στην ταχεία αποικοδόμηση τους και στη σύζευξη με μικρό τροποποιητή τύπου ουβικιτίνης (SUMO), ο οποίος αυξάνει τη συσσώρευσή τους. Επιπλέον, η δραστικότητα DELLA ρυθμίζεται δυναμικά από δύο διακριτούς μηχανισμούς γλυκοζυλίωσης: Η Ο-φουκοζυλίωση ενισχύει την αλληλεπίδραση DELLA-TF, ενώ η τροποποίηση με Ο-συνδεδεμένη Ν-ακετυλογλυκοζαμίνη (O-GlcNAc) αναστέλλει την αλληλεπίδραση DELLA-TF. Ωστόσο, ο ρόλος της φωσφορυλίωσης DELLA είναι ασαφής, καθώς προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει αντικρουόμενα αποτελέσματα, με ορισμένες να υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση προάγει ή καταστέλλει την αποικοδόμηση DELLA και άλλες να υποδηλώνουν ότι η φωσφορυλίωση δεν επηρεάζει τη σταθερότητά τους. Εδώ, εντοπίζουμε θέσεις φωσφορυλίωσης στον καταστολέα GA1-3 (RGA), AtDELLA, που καθαρίστηκε από το Arabidopsis thaliana με φασματομετρία μάζας και δείχνουμε ότι η φωσφορυλίωση δύο πεπτιδίων RGA στις περιοχές PolyS και PolyS/T ενισχύει τη δραστικότητα RGA προάγοντας τη σύνδεση H2A και τη σύνδεση RGA με υποκινητές-στόχους. Αξιοσημείωτα, η φωσφορυλίωση δεν επηρέασε τις αλληλεπιδράσεις RGA-TF ή τη σταθερότητα του RGA. Η μελέτη μας αποκαλύπτει έναν μοριακό μηχανισμό μέσω του οποίου η φωσφορυλίωση προκαλεί δραστηριότητα DELLA.
Η φασματομετρική μας ανάλυση μάζας αποκάλυψε ότι τόσο η Pep1 όσο και η Pep2 ήταν σε υψηλό βαθμό φωσφορυλιωμένες στο RGA στο υπόβαθρο Ga1 με έλλειψη GA. Εκτός από αυτή τη μελέτη, φωσφοπρωτεωμικές μελέτες έχουν επίσης αποκαλύψει φωσφορυλίωση Pep1 στο RGA, αν και ο ρόλος της δεν έχει ακόμη μελετηθεί53,54,55. Αντίθετα, η φωσφορυλίωση Pep2 δεν έχει περιγραφεί προηγουμένως, καθώς αυτό το πεπτίδιο μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο χρησιμοποιώντας το τρανςγονίδιο RGAGKG. Αν και η μετάλλαξη m1A, η οποία κατάργησε τη φωσφορυλίωση Pep1, μείωσε μόνο ελαφρώς τη δραστικότητα του RGA στα φυτά, είχε ένα αθροιστικό αποτέλεσμα όταν συνδυάστηκε με m2A στη μείωση της δραστικότητας του RGA (Συμπληρωματικό Σχήμα 6). Σημαντικό είναι ότι η φωσφορυλίωση Pep1 μειώθηκε σημαντικά στο μεταλλαγμένο sly1 με ενίσχυση GA σε σύγκριση με το ga1, υποδηλώνοντας ότι το GA προάγει την αποφωσφορυλίωση του RGA, μειώνοντας τη δραστικότητά του. Ο μηχανισμός με τον οποίο το GA καταστέλλει τη φωσφορυλίωση του RGA απαιτεί περαιτέρω διερεύνηση. Μια πιθανότητα είναι ότι αυτό επιτυγχάνεται μέσω της ρύθμισης μιας μη αναγνωρισμένης πρωτεϊνικής κινάσης. Παρόλο που μελέτες έχουν δείξει ότι η έκφραση της πρωτεϊνικής κινάσης CK1 EL1 υπορυθμίζεται από την GA στο ρύζι41, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι μεταλλάξεις υψηλότερης τάξης του ομολόγου EL1 της Arabidopsis (AEL1-4) δεν μειώνουν τη φωσφορυλίωση RGA. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματά μας, μια πρόσφατη φωσφοπρωτεωμική μελέτη που χρησιμοποίησε γραμμές που υπερεκφράζουν την Arabidopsis AEL και ένα τριπλό μεταλλαγμένο ael δεν αναγνώρισε καμία πρωτεΐνη DELLA ως υποστρώματα αυτών των κινασών56. Όταν ετοιμάσαμε το χειρόγραφο, αναφέρθηκε ότι η GSK3, το γονίδιο που κωδικοποιεί μια κινάση τύπου GSK3/SHAGGY στο σιτάρι (Triticum aestivum), μπορεί να φωσφορυλιώσει την DELLA (Rht-B1b)57, αν και η φωσφορυλίωση της Rht-B1b από την GSK3 δεν έχει επιβεβαιωθεί σε φυτά. Ενζυματικές αντιδράσεις in vitro παρουσία GSK3 ακολουθούμενες από ανάλυση φασματομετρίας μάζας αποκάλυψαν τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης που βρίσκονται μεταξύ των περιοχών DELLA και GRAS της Rht-B1b (Συμπληρωματικό Σχήμα 3). Οι υποκαταστάσεις σερίνης προς αλανίνη και στις τρεις θέσεις φωσφορυλίωσης οδήγησαν σε μειωμένη δραστικότητα Rht-B1b σε διαγονιδιακό σιτάρι, σύμφωνα με τα ευρήματά μας ότι οι υποκαταστάσεις αλανίνης στο Pep2 RGA μείωσαν τη δραστικότητα του RGA. Ωστόσο, οι δοκιμασίες αποικοδόμησης πρωτεϊνών in vitro κατέδειξαν περαιτέρω ότι η φωσφορυλίωση μπορεί επίσης να σταθεροποιήσει το Rht-B1b57. Αυτό έρχεται σε αντίθεση με τα αποτελέσματά μας που δείχνουν ότι οι υποκαταστάσεις αλανίνης στο Pep2 RGA δεν μεταβάλλουν τη σταθερότητά του στα φυτά. Η GSK3 στο σιτάρι είναι ένα ορθόλογο της πρωτεΐνης 2 που δεν είναι ευαίσθητη στα μπρασινοστεροειδή (BIN2) στο Arabidopsis 57. Το BIN2 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της σηματοδότησης BR και το BR ενεργοποιεί την οδό σηματοδότησης προκαλώντας αποικοδόμηση BIN2 58. Δείξαμε ότι η επεξεργασία με BR δεν μειώνει τη σταθερότητα του RGA 59 ή τα επίπεδα φωσφορυλίωσης στο Arabidopsis (Συμπληρωματικό Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι το RGA είναι απίθανο να φωσφορυλιωθεί από το BIN2.
Όλα τα ποσοτικά δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά χρησιμοποιώντας το Excel και οι σημαντικές διαφορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας το t-test του Student. Δεν χρησιμοποιήθηκαν στατιστικές μέθοδοι για τον προκαθορισμό του μεγέθους του δείγματος. Κανένα δεδομένο δεν εξαιρέθηκε από την ανάλυση. Το πείραμα δεν ήταν τυχαιοποιημένο και οι ερευνητές γνώριζαν την κατανομή κατά τη διάρκεια του πειράματος και της αξιολόγησης των αποτελεσμάτων. Τα μεγέθη των δειγμάτων παρέχονται στους υπόμνημες των σχημάτων και στα αρχεία ακατέργαστων δεδομένων.
Ώρα δημοσίευσης: 15 Απριλίου 2025