Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τη θνησιμότητα, την υποθνησιμότητα και την τοξικότητα των εμπορικώνκυπερμεθρίνησκευάσματα σε γυρίνους anuran. Στην οξεία δοκιμή, ελέγχθηκαν συγκεντρώσεις 100–800 μg/L για 96 ώρες. Στη χρόνια δοκιμή, ελέγχθηκαν οι φυσικώς απαντώμενες συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (1, 3, 6 και 20 μg/L) για θνησιμότητα, ακολουθούμενες από μικροπυρηνική δοκιμή και πυρηνικές ανωμαλίες ερυθρών αιμοσφαιρίων για 7 ημέρες. Η LC50 της εμπορικής σύνθεσης κυπερμεθρίνης στους γυρίνους ήταν 273,41 μg L−1. Στη χρόνια δοκιμή, η υψηλότερη συγκέντρωση (20 μg L−1) είχε ως αποτέλεσμα θνησιμότητα μεγαλύτερη από 50%, καθώς σκότωσε τους μισούς από τους γυρίνους που εξετάστηκαν. Η μικροπυρηνική δοκιμή έδειξε σημαντικά αποτελέσματα στα 6 και 20 μg L−1 και ανιχνεύθηκαν αρκετές πυρηνικές ανωμαλίες, υποδεικνύοντας ότι η εμπορική σύνθεση κυπερμεθρίνης έχει γονιδιοτοξικό δυναμικό έναντι του P. gracilis. Η κυπερμεθρίνη αποτελεί υψηλό κίνδυνο για αυτό το είδος, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να προκαλέσει πολλαπλά προβλήματα και να επηρεάσει τη δυναμική αυτού του οικοσυστήματος βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα. Συνεπώς, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης έχουν τοξικές επιδράσεις στο P. gracilis.
Λόγω της συνεχούς επέκτασης των γεωργικών δραστηριοτήτων και της εντατικής εφαρμογήςέλεγχος παρασίτωνμέτρα, τα υδρόβια ζώα εκτίθενται συχνά σε φυτοφάρμακα1,2. Η ρύπανση των υδάτινων πόρων κοντά σε γεωργικές εκτάσεις μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη και την επιβίωση μη στοχευόμενων οργανισμών, όπως τα αμφίβια.
Τα αμφίβια αποκτούν ολοένα και μεγαλύτερη σημασία στην αξιολόγηση των περιβαλλοντικών μητρών. Τα άνουρα θεωρούνται καλοί βιοδείκτες περιβαλλοντικών ρύπων λόγω των μοναδικών χαρακτηριστικών τους, όπως οι σύνθετοι κύκλοι ζωής, οι ταχείς ρυθμοί ανάπτυξης των προνυμφών, η τροφική κατάσταση, το διαπερατό δέρμα10,11, η εξάρτηση από το νερό για αναπαραγωγή12 και τα μη προστατευμένα αυγά11,13,14. Ο μικρός υδρόβιος βάτραχος (Physalaemus gracilis), κοινώς γνωστός ως βάτραχος που κλαίει, έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα είδος βιοδείκτη ρύπανσης από φυτοφάρμακα4,5,6,7,15. Το είδος βρίσκεται σε στάσιμα νερά, προστατευόμενες περιοχές ή περιοχές με μεταβλητό βιότοπο στην Αργεντινή, την Ουρουγουάη, την Παραγουάη και τη Βραζιλία1617 και θεωρείται σταθερό από την ταξινόμηση της IUCN λόγω της ευρείας κατανομής και της ανοχής του σε διαφορετικά βιότοπα18.
Έχουν αναφερθεί υποθανατηφόρες επιδράσεις σε αμφίβια μετά από έκθεση σε κυπερμεθρίνη, συμπεριλαμβανομένων συμπεριφορικών, μορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών στους γυρίνους23,24,25, μεταβολής της θνησιμότητας και του χρόνου μεταμόρφωσης, ενζυματικών αλλαγών, μειωμένης επιτυχίας εκκόλαψης24,25, υπερδραστηριότητας26, αναστολής της δράσης της χολινεστεράσης27 και αλλαγών στην κολυμβητική απόδοση7,28. Ωστόσο, οι μελέτες των γονιδιοτοξικών επιδράσεων της κυπερμεθρίνης στα αμφίβια είναι περιορισμένες. Επομένως, είναι σημαντικό να αξιολογηθεί η ευαισθησία των ειδών ανουράν στην κυπερμεθρίνη.
Η περιβαλλοντική ρύπανση επηρεάζει την κανονική ανάπτυξη και ανάπτυξη των αμφιβίων, αλλά η πιο σοβαρή αρνητική επίδραση είναι η γενετική βλάβη στο DNA που προκαλείται από την έκθεση σε φυτοφάρμακα13. Η ανάλυση μορφολογίας των αιμοσφαιρίων είναι ένας σημαντικός βιοδείκτης ρύπανσης και πιθανής τοξικότητας μιας ουσίας για τα άγρια είδη29. Η δοκιμή μικροπυρήνα είναι μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τον προσδιορισμό της γονιδιοτοξικότητας των χημικών ουσιών στο περιβάλλον30. Είναι μια γρήγορη, αποτελεσματική και φθηνή μέθοδος που αποτελεί καλό δείκτη χημικής ρύπανσης οργανισμών όπως τα αμφίβια31,32 και μπορεί να παρέχει πληροφορίες σχετικά με την έκθεση σε γονιδιοτοξικούς ρύπους33.
Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν η αξιολόγηση της τοξικότητας των εμπορικών σκευασμάτων κυπερμεθρίνης σε μικρούς υδρόβιους γυρίνους χρησιμοποιώντας δοκιμή μικροπυρήνα και αξιολόγηση οικολογικού κινδύνου.
Συνολική θνησιμότητα (%) των γυρίνων P. gracilis που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εμπορικής κυπερμεθρίνης κατά την οξεία περίοδο της δοκιμής.
Συνολική θνησιμότητα (%) γυρίνων P. gracilis που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εμπορικής κυπερμεθρίνης κατά τη διάρκεια μιας χρόνιας δοκιμής.
Η παρατηρούμενη υψηλή θνησιμότητα ήταν αποτέλεσμα γονιδιοτοξικών επιδράσεων σε αμφίβια που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (6 και 20 μg/L), όπως αποδεικνύεται από την παρουσία μικροπυρήνων (MN) και πυρηνικών ανωμαλιών στα ερυθροκύτταρα. Ο σχηματισμός MN υποδηλώνει σφάλματα στη μίτωση και σχετίζεται με κακή σύνδεση χρωμοσωμάτων με μικροσωληνίσκους, ελαττώματα σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα που είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη και μεταφορά των χρωμοσωμάτων, σφάλματα στον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και σφάλματα στην επιδιόρθωση βλαβών του DNA38,39 και μπορεί να σχετίζεται με οξειδωτικό στρες που προκαλείται από φυτοφάρμακα40,41. Άλλες ανωμαλίες παρατηρήθηκαν σε όλες τις συγκεντρώσεις που αξιολογήθηκαν. Η αύξηση των συγκεντρώσεων κυπερμεθρίνης αύξησε τις πυρηνικές ανωμαλίες στα ερυθροκύτταρα κατά 5% και 20% στις χαμηλότερες (1 μg/L) και υψηλότερες (20 μg/L) δόσεις, αντίστοιχα. Για παράδειγμα, οι αλλαγές στο DNA ενός είδους μπορούν να έχουν σοβαρές συνέπειες τόσο για τη βραχυπρόθεσμη όσο και για τη μακροπρόθεσμη επιβίωση, με αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού, την αλλοιωμένη αναπαραγωγική ικανότητα, την ενδογαμία, την απώλεια γενετικής ποικιλομορφίας και τους αλλοιωμένους ρυθμούς μετανάστευσης. Όλοι αυτοί οι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την επιβίωση και τη διατήρηση των ειδών42,43. Ο σχηματισμός ερυθροειδών ανωμαλιών μπορεί να υποδηλώνει μπλοκάρισμα στην κυτοκίνηση, με αποτέλεσμα ανώμαλη κυτταρική διαίρεση (διπύρηνα ερυθροκύτταρα)44,45. Οι πολυλοβοί πυρήνες είναι προεξοχές της πυρηνικής μεμβράνης με πολλαπλούς λοβούς46, ενώ άλλες ερυθροειδείς ανωμαλίες μπορεί να σχετίζονται με ενίσχυση DNA, όπως πυρηνικοί νεφροί/φυσαλίδες47. Η παρουσία πυρηνικών ερυθροκυττάρων μπορεί να υποδηλώνει μειωμένη μεταφορά οξυγόνου, ειδικά σε μολυσμένο νερό48,49. Η απόπτωση υποδηλώνει κυτταρικό θάνατο50.
Άλλες μελέτες έχουν επίσης καταδείξει τις γονιδιοτοξικές επιδράσεις της κυπερμεθρίνης. Οι Kabaña et al.51 κατέδειξαν την παρουσία μικροπυρήνων και πυρηνικών αλλαγών, όπως διπύρηνα κύτταρα και αποπτωτικά κύτταρα, σε κύτταρα Odontophrynus americanus μετά από έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (5000 και 10.000 μg L−1) για 96 ώρες. Απόπτωση που προκαλείται από κυπερμεθρίνη ανιχνεύθηκε επίσης σε P. biligonigerus52 και Rhinella arenarum53. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η κυπερμεθρίνη έχει γονιδιοτοξικές επιδράσεις σε μια σειρά υδρόβιων οργανισμών και ότι η δοκιμασία MN και ENA μπορεί να αποτελεί δείκτη υποθανατηφόρων επιδράσεων στα αμφίβια και μπορεί να είναι εφαρμόσιμη σε ιθαγενή είδη και άγριους πληθυσμούς που εκτίθενται σε τοξικές ουσίες12.
Τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης ενέχουν υψηλό περιβαλλοντικό κίνδυνο (τόσο οξύ όσο και χρόνιο), με τις συγκεντρώσεις HQ να υπερβαίνουν το επίπεδο της Υπηρεσίας Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ (EPA)54 και να μπορούν να επηρεάσουν αρνητικά το είδος εάν υπάρχουν στο περιβάλλον. Στην αξιολόγηση χρόνιου κινδύνου, η NOEC για τη θνησιμότητα ήταν 3 μg L−1, επιβεβαιώνοντας ότι οι συγκεντρώσεις που βρέθηκαν στο νερό μπορεί να αποτελούν κίνδυνο για το είδος55. Η θανατηφόρα NOEC για τις προνύμφες του R. arenarum που εκτέθηκαν σε μείγμα ενδοσουλφάνης και κυπερμεθρίνης ήταν 500 μg L−1 μετά από 168 ώρες. Η τιμή αυτή μειώθηκε σε 0,0005 μg L−1 μετά από 336 ώρες. Οι συγγραφείς δείχνουν ότι όσο μεγαλύτερη είναι η έκθεση, τόσο χαμηλότερες είναι οι συγκεντρώσεις που είναι επιβλαβείς για το είδος. Είναι επίσης σημαντικό να επισημανθεί ότι οι τιμές NOEC ήταν υψηλότερες από αυτές του P. gracilis στον ίδιο χρόνο έκθεσης, υποδεικνύοντας ότι η απόκριση του είδους στην κυπερμεθρίνη είναι ειδική για το είδος. Επιπλέον, όσον αφορά τη θνησιμότητα, η τιμή CHQ του P. gracilis μετά την έκθεση στην κυπερμεθρίνη έφτασε το 64,67, η οποία είναι υψηλότερη από την τιμή αναφοράς που έχει ορίσει η Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ54, και η τιμή CHQ των προνυμφών του R. arenarum ήταν επίσης υψηλότερη από αυτήν την τιμή (CHQ > 388,00 μετά από 336 ώρες), υποδεικνύοντας ότι τα εντομοκτόνα που μελετήθηκαν ενέχουν υψηλό κίνδυνο για πολλά είδη αμφιβίων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το P. gracilis απαιτεί περίπου 30 ημέρες για να ολοκληρώσει τη μεταμόρφωση56, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι οι συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης που μελετήθηκαν μπορούν να συμβάλουν στη μείωση του πληθυσμού, εμποδίζοντας τα μολυσμένα άτομα να εισέλθουν στο στάδιο της ενηλικίωσης ή της αναπαραγωγής σε νεαρή ηλικία.
Στην υπολογισμένη αξιολόγηση κινδύνου μικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωμαλιών των ερυθροκυττάρων, οι τιμές CHQ κυμαίνονταν από 14,92 έως 97,00, υποδεικνύοντας ότι η κυπερμεθρίνη είχε πιθανό γονοτοξικό κίνδυνο για το P. gracilis ακόμη και στο φυσικό του περιβάλλον. Λαμβάνοντας υπόψη τη θνησιμότητα, η μέγιστη συγκέντρωση ξενοβιοτικών ενώσεων που ήταν ανεκτή για το P. gracilis ήταν 4,24 μg L−1. Ωστόσο, συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 1 μg/L έδειξαν επίσης γονοτοξικές επιδράσεις. Αυτό το γεγονός μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του αριθμού των μη φυσιολογικών ατόμων57 και να επηρεάσει την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή των ειδών στα ενδιαιτήματά τους, οδηγώντας σε μείωση των πληθυσμών των αμφιβίων.
Τα εμπορικά σκευάσματα του εντομοκτόνου κυπερμεθρίνης έδειξαν υψηλή οξεία και χρόνια τοξικότητα στο P. gracilis. Παρατηρήθηκαν υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας, πιθανώς λόγω τοξικών επιδράσεων, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία μικροπυρήνων και πυρηνικών ανωμαλιών των ερυθροκυττάρων, ιδιαίτερα οδοντωτών πυρήνων, λοβωτών πυρήνων και κυστιδιακών πυρήνων. Επιπλέον, τα είδη που μελετήθηκαν έδειξαν αυξημένους περιβαλλοντικούς κινδύνους, τόσο οξείς όσο και χρόνιους. Αυτά τα δεδομένα, σε συνδυασμό με προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, έδειξαν ότι ακόμη και διαφορετικά εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης προκάλεσαν μειωμένες δραστηριότητες ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και βουτυρυλοχολινεστεράσης (BChE) και οξειδωτικό στρες58, και οδήγησαν σε αλλαγές στη δραστηριότητα κολύμβησης και στοματικές δυσπλασίες59 στο P. gracilis, υποδεικνύοντας ότι τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης έχουν υψηλή θανατηφόρα και υποθανατηφόρα τοξικότητα σε αυτό το είδος. Οι Hartmann et al. 60 διαπίστωσαν ότι τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης ήταν τα πιο τοξικά για το P. gracilis και ένα άλλο είδος του ίδιου γένους (P. cuvieri) σε σύγκριση με εννέα άλλα φυτοφάρμακα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι νόμιμα εγκεκριμένες συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης για την προστασία του περιβάλλοντος ενδέχεται να οδηγήσουν σε υψηλή θνησιμότητα και μακροπρόθεσμη μείωση του πληθυσμού.
Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την αξιολόγηση της τοξικότητας του φυτοφαρμάκου στα αμφίβια, καθώς οι συγκεντρώσεις που βρίσκονται στο περιβάλλον μπορεί να προκαλέσουν υψηλή θνησιμότητα και να αποτελέσουν πιθανό κίνδυνο για το P. gracilis. Η έρευνα για τα είδη αμφιβίων θα πρέπει να ενθαρρύνεται, καθώς τα δεδομένα για αυτούς τους οργανισμούς είναι ελάχιστα, ιδίως για τα βραζιλιάνικα είδη.
Η δοκιμή χρόνιας τοξικότητας διήρκεσε 168 ώρες (7 ημέρες) υπό στατικές συνθήκες και οι υποθανατηφόρες συγκεντρώσεις ήταν: 1, 3, 6 και 20 μg ai L−1. Και στα δύο πειράματα, αξιολογήθηκαν 10 γυρίνοι ανά ομάδα θεραπείας με έξι επαναλήψεις, για συνολικά 60 γυρίνους ανά συγκέντρωση. Εν τω μεταξύ, η θεραπεία μόνο με νερό χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Κάθε πειραματική διάταξη αποτελούνταν από ένα αποστειρωμένο γυάλινο πιάτο χωρητικότητας 500 ml και πυκνότητας 1 γυρίνου ανά 50 ml διαλύματος. Η φιάλη καλύφθηκε με μεμβράνη πολυαιθυλενίου για την αποφυγή εξάτμισης και αεριζόταν συνεχώς.
Το νερό αναλύθηκε χημικά για τον προσδιορισμό των συγκεντρώσεων φυτοφαρμάκων στις 0, 96 και 168 ώρες. Σύμφωνα με τους Sabin et al. 68 και Martins et al. 69, οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Ανάλυσης Φυτοφαρμάκων (LARP) του Ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου της Santa Maria χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφία σε συνδυασμό με τριπλή τετραπολική φασματομετρία μάζας (Varian model 1200, Palo Alto, California, USA). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των φυτοφαρμάκων στο νερό παρουσιάζεται ως συμπληρωματικό υλικό (Πίνακας SM1).
Για τη δοκιμή μικροπυρήνα (MNT) και τη δοκιμή πυρηνικής ανωμαλίας ερυθρών αιμοσφαιρίων (RNA), αναλύθηκαν 15 γυρίνοι από κάθε ομάδα θεραπείας. Οι γυρίνοι αναισθητοποιήθηκαν με 5% λιδοκαΐνη (50 mg g-170) και δείγματα αίματος συλλέχθηκαν με καρδιακή παρακέντηση χρησιμοποιώντας σύριγγες μίας χρήσης με ηπαρίνη. Τα επιχρίσματα αίματος παρασκευάστηκαν σε αποστειρωμένες αντικειμενοφόρες πλάκες μικροσκοπίου, ξηράνθηκαν στον αέρα, σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη (4 °C) για 2 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa 10% για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Στο τέλος της διαδικασίας, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για την απομάκρυνση της περίσσειας χρώσης και ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.
Τουλάχιστον 1000 ερυθρά αιμοσφαίρια από κάθε γυρίνο αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο 100× με αντικειμενικό φακό 71 για τον προσδιορισμό της παρουσίας MN και ENA. Συνολικά 75.796 ερυθρά αιμοσφαίρια από γυρίνους αξιολογήθηκαν λαμβάνοντας υπόψη τις συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης και τους μάρτυρες. Η γονιδιοτοξικότητα αναλύθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Carrasco et al. και Fenech et al.38,72 προσδιορίζοντας τη συχνότητα των ακόλουθων πυρηνικών αλλοιώσεων: (1) απύρηνα κύτταρα: κύτταρα χωρίς πυρήνες· (2) αποπτωτικά κύτταρα: πυρηνικός κατακερματισμός, προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος· (3) διπύρηνα κύτταρα: κύτταρα με δύο πυρήνες· (4) πυρηνικά μπουμπούκια ή κύτταρα κύστεων: κύτταρα με πυρήνες με μικρές προεξοχές της πυρηνικής μεμβράνης, κύστεις παρόμοιες σε μέγεθος με τους μικροπυρήνες· (5) καρυολυμένα κύτταρα: κύτταρα με μόνο το περίγραμμα του πυρήνα χωρίς εσωτερικό υλικό· (6) εγκοπή κύτταρα: κύτταρα με πυρήνες με εμφανείς ρωγμές ή εγκοπές στο σχήμα τους, που ονομάζονται επίσης πυρήνες σε σχήμα νεφρού· (7) λοβωμένα κύτταρα: κύτταρα με πυρηνικές προεξοχές μεγαλύτερες από τα προαναφερθέντα κυστίδια· και (8) μικροκύτταρα: κύτταρα με συμπυκνωμένους πυρήνες και μειωμένο κυτταρόπλασμα. Οι αλλαγές συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα του αρνητικού μάρτυρα.
Τα αποτελέσματα των δοκιμών οξείας τοξικότητας (LC50) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GBasic και τη μέθοδο TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Τα δεδομένα των δοκιμών χρόνιας τοξικότητας προελέγχθηκαν για κανονικότητα σφάλματος (Shapiro-Wilks) και ομοιογένεια διακύμανσης (Bartlett). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονομερή ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Η δοκιμή Tukey χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ τους και η δοκιμή Dunnett χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ της ομάδας θεραπείας και της ομάδας αρνητικού ελέγχου.
Τα δεδομένα LOEC και NOEC αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το τεστ Dunnett. Οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistica 8.0 (StatSoft) με επίπεδο σημαντικότητας 95% (p < 0,05).
Ώρα δημοσίευσης: 13 Μαρτίου 2025