Αυτή η μελέτη αξιολόγησε τη θνησιμότητα, την υποθνησιμότητα και την τοξικότητα των εμπορικώνκυπερμεθρίνησκευάσματα σε γυρίνους anuran. Στην οξεία δοκιμή, οι συγκεντρώσεις 100–800 μg/L δοκιμάστηκαν για 96 ώρες. Στη χρόνια δοκιμή, οι φυσικές συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (1, 3, 6 και 20 μg/L) δοκιμάστηκαν για θνησιμότητα, ακολουθούμενες από δοκιμή μικροπυρήνων και πυρηνικές ανωμαλίες ερυθρών αιμοσφαιρίων για 7 ημέρες. Το LC50 της εμπορικής σύνθεσης κυπερμεθρίνης σε γυρίνους ήταν 273,41 μg L−1. Στο χρόνιο τεστ, η υψηλότερη συγκέντρωση (20 μg L−1) είχε ως αποτέλεσμα μεγαλύτερη από 50% θνησιμότητα, καθώς σκότωσε τους μισούς γυρίνους που δοκιμάστηκαν. Η δοκιμή μικροπυρήνων έδειξε σημαντικά αποτελέσματα στα 6 και 20 μg L−1 και εντοπίστηκαν αρκετές πυρηνικές ανωμαλίες, υποδεικνύοντας ότι η εμπορική σύνθεση κυπερμεθρίνης έχει γονιδιοτοξικό δυναμικό έναντι του P. gracilis. Η κυπερμεθρίνη αποτελεί υψηλό κίνδυνο για αυτό το είδος, υποδεικνύοντας ότι μπορεί να προκαλέσει πολλαπλά προβλήματα και να επηρεάσει τη δυναμική αυτού του οικοσυστήματος βραχυπρόθεσμα και μακροπρόθεσμα. Επομένως, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι οι εμπορικές συνθέσεις κυπερμεθρίνης έχουν τοξικές επιδράσεις στο P. gracilis.
Λόγω της συνεχούς επέκτασης των αγροτικών δραστηριοτήτων και της εντατικής εφαρμογής τουέλεγχος παρασίτωνμέτρα, τα υδρόβια ζώα εκτίθενται συχνά σε φυτοφάρμακα1,2. Η ρύπανση των υδάτινων πόρων κοντά σε γεωργικά χωράφια μπορεί να επηρεάσει την ανάπτυξη και την επιβίωση οργανισμών που δεν αποτελούν στόχο, όπως τα αμφίβια.
Τα αμφίβια γίνονται ολοένα και πιο σημαντικά στην αξιολόγηση των περιβαλλοντικών μητρών. Τα ανουράνια θεωρούνται καλοί βιοδείκτες περιβαλλοντικών ρύπων λόγω των μοναδικών χαρακτηριστικών τους όπως οι πολύπλοκοι κύκλοι ζωής, οι γρήγοροι ρυθμοί ανάπτυξης των προνυμφών, η τροφική κατάσταση, το διαπερατό δέρμα10,11, η εξάρτηση από το νερό για την αναπαραγωγή12 και τα απροστάτευτα αυγά11,13,14. Ο μικρός νερόβατρας (Physalaemus gracilis), κοινώς γνωστός ως ο βάτραχος που κλαίει, έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα είδος βιοδείκτη της ρύπανσης από φυτοφάρμακα4,5,6,7,15. Το είδος βρίσκεται σε στάσιμα ύδατα, προστατευόμενες περιοχές ή περιοχές με μεταβλητό βιότοπο στην Αργεντινή, την Ουρουγουάη, την Παραγουάη και τη Βραζιλία1617 και θεωρείται σταθερό από την ταξινόμηση της IUCN λόγω της ευρείας κατανομής και της ανοχής του σε διαφορετικούς οικοτόπους18.
Έχουν αναφερθεί υποθανατηφόρες επιδράσεις σε αμφίβια μετά από έκθεση στην κυπερμεθρίνη, συμπεριλαμβανομένων συμπεριφορικών, μορφολογικών και βιοχημικών αλλαγών στους γυρίνους23,24,25, μεταβολής της θνησιμότητας και του χρόνου μεταμόρφωσης, ενζυματικές αλλαγές, μειωμένη επιτυχία εκκόλαψης24,25, υπερκινητικότητα26, αναστολή της δραστηριότητας 27 ωρίμανσης και αναστολή της δραστηριότητας της 27μίνεσης. Ωστόσο, οι μελέτες για τις γονιδιοτοξικές επιδράσεις της κυπερμεθρίνης σε αμφίβια είναι περιορισμένες. Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να αξιολογηθεί η ευαισθησία των ειδών anuran στην κυπερμεθρίνη.
Η περιβαλλοντική ρύπανση επηρεάζει την κανονική ανάπτυξη και ανάπτυξη των αμφιβίων, αλλά η πιο σοβαρή αρνητική επίδραση είναι η γενετική βλάβη στο DNA που προκαλείται από την έκθεση σε φυτοφάρμακα13. Η ανάλυση της μορφολογίας των αιμοσφαιρίων είναι ένας σημαντικός βιοδείκτης της ρύπανσης και της πιθανής τοξικότητας μιας ουσίας σε άγρια είδη29. Η δοκιμή μικροπυρήνων είναι μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους για τον προσδιορισμό της γονοτοξικότητας των χημικών ουσιών στο περιβάλλον30. Είναι μια γρήγορη, αποτελεσματική και φθηνή μέθοδος που αποτελεί καλό δείκτη χημικής ρύπανσης οργανισμών όπως τα αμφίβια31,32 και μπορεί να παρέχει πληροφορίες για την έκθεση σε γονιδιοτοξικούς ρύπους33.
Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογήσει το τοξικό δυναμικό των εμπορικών σκευασμάτων κυπερμεθρίνης σε μικρούς υδρόβιους γυρίνους χρησιμοποιώντας μια δοκιμή μικροπυρήνων και εκτίμηση οικολογικού κινδύνου.
Σωρευτική θνησιμότητα (%) των γυρίνων P. gracilis που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εμπορικής κυπερμεθρίνης κατά την οξεία περίοδο της δοκιμής.
Σωρευτική θνησιμότητα (%) των γυρίνων P. gracilis που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εμπορικής κυπερμεθρίνης κατά τη διάρκεια μιας χρόνιας δοκιμής.
Η παρατηρούμενη υψηλή θνησιμότητα ήταν αποτέλεσμα γονοτοξικών επιδράσεων σε αμφίβια που εκτέθηκαν σε διαφορετικές συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (6 και 20 μg/L), όπως αποδεικνύεται από την παρουσία μικροπυρήνων (MN) και πυρηνικές ανωμαλίες στα ερυθροκύτταρα. Ο σχηματισμός ΜΝ υποδηλώνει σφάλματα στη μίτωση και σχετίζεται με κακή σύνδεση χρωμοσωμάτων με μικροσωληνίσκους, ελαττώματα σε πρωτεϊνικά σύμπλοκα που είναι υπεύθυνα για την πρόσληψη και μεταφορά χρωμοσωμάτων, σφάλματα στον διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων και σφάλματα στην επιδιόρθωση βλάβης του DNA38,39 και μπορεί να σχετίζονται με το στρες που προκαλείται από φυτοφάρμακα4041. Άλλες ανωμαλίες παρατηρήθηκαν σε όλες τις συγκεντρώσεις που αξιολογήθηκαν. Η αύξηση των συγκεντρώσεων της κυπερμεθρίνης αύξησε τις πυρηνικές ανωμαλίες στα ερυθροκύτταρα κατά 5% και 20% στη χαμηλότερη (1 μg/L) και στην υψηλότερη (20 μg/L) δόσεις, αντίστοιχα. Για παράδειγμα, οι αλλαγές στο DNA ενός είδους μπορεί να έχουν σοβαρές συνέπειες τόσο για τη βραχυπρόθεσμη όσο και για τη μακροπρόθεσμη επιβίωση, με αποτέλεσμα τη μείωση του πληθυσμού, τη μεταβολή της αναπαραγωγικής ικανότητας, την αιμομιξία, την απώλεια γενετικής ποικιλότητας και τα μεταβαλλόμενα ποσοστά μετανάστευσης. Όλοι αυτοί οι παράγοντες μπορούν να επηρεάσουν την επιβίωση και τη συντήρηση των ειδών42,43. Ο σχηματισμός ερυθροειδών ανωμαλιών μπορεί να υποδηλώνει αποκλεισμό στην κυτταροκίνηση, με αποτέλεσμα ανώμαλη κυτταρική διαίρεση (διπύρηνα ερυθροκύτταρα)44,45. Οι πολυλοβικοί πυρήνες είναι προεξοχές της πυρηνικής μεμβράνης με πολλαπλούς λοβούς46, ενώ άλλες ερυθροειδείς ανωμαλίες μπορεί να σχετίζονται με την ενίσχυση του DNA, όπως οι πυρηνικοί νεφροί/βλάσκες47. Η παρουσία πυρηνοποιημένων ερυθροκυττάρων μπορεί να υποδηλώνει μειωμένη μεταφορά οξυγόνου, ειδικά σε μολυσμένο νερό48,49. Η απόπτωση υποδηλώνει κυτταρικό θάνατο50.
Άλλες μελέτες έχουν επίσης καταδείξει τις γονιδιοτοξικές επιδράσεις της κυπερμεθρίνης. Οι Kabaña et al.51 κατέδειξαν την παρουσία μικροπυρήνων και πυρηνικών αλλαγών, όπως διπύρηνων κυττάρων και αποπτωτικών κυττάρων στα κύτταρα Odontophrynus americanus μετά από έκθεση σε υψηλές συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης (5000 και 10.000 μg L−1) για 96 ώρες. Η απόπτωση που προκαλείται από κυπερμεθρίνη ανιχνεύθηκε επίσης στο P. biligonigerus52 και στο Rhinella arenarum53. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η κυπερμεθρίνη έχει γονοτοξικές επιδράσεις σε μια σειρά υδρόβιων οργανισμών και ότι η ανάλυση MN και ENA μπορεί να είναι δείκτης υποθανατηφόρων επιδράσεων στα αμφίβια και μπορεί να είναι εφαρμόσιμη σε αυτόχθονα είδη και άγριους πληθυσμούς που εκτίθενται σε τοξικές ουσίες12.
Τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης αποτελούν υψηλό περιβαλλοντικό κίνδυνο (τόσο οξύ όσο και χρόνιο), με τα κεντρικά γραφεία να υπερβαίνουν το επίπεδο της Υπηρεσίας Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ (EPA)54 που μπορεί να επηρεάσει δυσμενώς το είδος εάν υπάρχει στο περιβάλλον. Στην αξιολόγηση χρόνιου κινδύνου, το NOEC για τη θνησιμότητα ήταν 3 μg L−1, επιβεβαιώνοντας ότι οι συγκεντρώσεις που βρέθηκαν στο νερό ενδέχεται να ενέχουν κίνδυνο για το είδος55. Το θανατηφόρο NOEC για τις προνύμφες R. arenarum που εκτέθηκαν σε ένα μείγμα ενδοσουλφάνης και κυπερμεθρίνης ήταν 500 μg L−1 μετά από 168 ώρες. αυτή η τιμή μειώθηκε στα 0,0005 μg L−1 μετά από 336 ώρες. Οι συγγραφείς δείχνουν ότι όσο μεγαλύτερη είναι η έκθεση, τόσο χαμηλότερες είναι οι συγκεντρώσεις που είναι επιβλαβείς για το είδος. Είναι επίσης σημαντικό να επισημανθεί ότι οι τιμές NOEC ήταν υψηλότερες από αυτές του P. gracilis στον ίδιο χρόνο έκθεσης, υποδεικνύοντας ότι η απόκριση του είδους στην κυπερμεθρίνη είναι συγκεκριμένη για το είδος. Επιπλέον, όσον αφορά τη θνησιμότητα, η τιμή CHQ του P. gracilis μετά την έκθεση στην κυπερμεθρίνη έφτασε το 64,67, που είναι υψηλότερη από την τιμή αναφοράς που όρισε η Υπηρεσία Προστασίας του Περιβάλλοντος των ΗΠΑ54, και η τιμή CHQ των προνυμφών R. arenarum ήταν επίσης υψηλότερη από αυτήν την τιμή (CHQ > 3836 που μελετήθηκε). αποτελούν υψηλό κίνδυνο για πολλά είδη αμφιβίων. Λαμβάνοντας υπόψη ότι το P. gracilis απαιτεί περίπου 30 ημέρες για να ολοκληρωθεί η μεταμόρφωση56, μπορεί να συναχθεί το συμπέρασμα ότι οι συγκεντρώσεις της κυπερμεθρίνης που μελετήθηκαν μπορεί να συμβάλλουν στη μείωση του πληθυσμού εμποδίζοντας τα μολυσμένα άτομα να εισέλθουν στο ενήλικο ή αναπαραγωγικό στάδιο σε νεαρή ηλικία.
Στην υπολογισμένη εκτίμηση κινδύνου των μικροπυρήνων και άλλων πυρηνικών ανωμαλιών των ερυθροκυττάρων, οι τιμές CHQ κυμαίνονταν από 14,92 έως 97,00, υποδεικνύοντας ότι η κυπερμεθρίνη είχε δυνητικό γονοτοξικό κίνδυνο για το P. gracilis ακόμη και στο φυσικό του περιβάλλον. Λαμβάνοντας υπόψη τη θνησιμότητα, η μέγιστη συγκέντρωση ξενοβιοτικών ενώσεων που ήταν ανεκτή στο P. gracilis ήταν 4,24 μg L−1. Ωστόσο, συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 1 μg/L έδειξαν επίσης γονιδιοτοξικές επιδράσεις. Το γεγονός αυτό μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση του αριθμού των μη φυσιολογικών ατόμων57 και να επηρεάσει την ανάπτυξη και την αναπαραγωγή ειδών στα ενδιαιτήματά τους, οδηγώντας σε μείωση των πληθυσμών των αμφιβίων.
Οι εμπορικές συνθέσεις του εντομοκτόνου cypermethrin έδειξαν υψηλή οξεία και χρόνια τοξικότητα στο P. gracilis. Παρατηρήθηκαν υψηλότερα ποσοστά θνησιμότητας, πιθανότατα λόγω τοξικών επιδράσεων, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία μικροπυρήνων και πυρηνικών ανωμαλιών ερυθροκυττάρων, ιδιαίτερα οδοντωτών πυρήνων, λοβωτών πυρήνων και φυσαλιδώδους πυρήνων. Επιπλέον, τα είδη που μελετήθηκαν εμφάνισαν αυξημένους περιβαλλοντικούς κινδύνους, οξείς και χρόνιους. Αυτά τα δεδομένα, σε συνδυασμό με προηγούμενες μελέτες της ερευνητικής μας ομάδας, έδειξαν ότι ακόμη και διαφορετικά εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης εξακολουθούν να προκαλούν μειωμένες δραστηριότητες ακετυλοχολινεστεράσης (AChE) και βουτυρυλοχολινεστεράσης (BChE) και οξειδωτικό στρες58 και οδήγησαν σε αλλαγές στην κολυμβητική δραστηριότητα και στοματικές δυσμορφίες59 στο P. gracilis. τοξικότητα σε αυτό το είδος. Hartmann et al. 60 διαπίστωσαν ότι τα εμπορικά σκευάσματα κυπερμεθρίνης ήταν τα πιο τοξικά για το P. gracilis και ένα άλλο είδος του ίδιου γένους (P. cuvieri) σε σύγκριση με άλλα εννέα φυτοφάρμακα. Αυτό υποδηλώνει ότι οι νομικά εγκεκριμένες συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης για προστασία του περιβάλλοντος μπορεί να οδηγήσουν σε υψηλή θνησιμότητα και μακροπρόθεσμη μείωση του πληθυσμού.
Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για την αξιολόγηση της τοξικότητας του φυτοφαρμάκου στα αμφίβια, καθώς οι συγκεντρώσεις που βρίσκονται στο περιβάλλον μπορεί να προκαλέσουν υψηλή θνησιμότητα και να θέτουν δυνητικό κίνδυνο για το P. gracilis. Θα πρέπει να ενθαρρυνθεί η έρευνα για τα αμφίβια είδη, καθώς τα δεδομένα για αυτούς τους οργανισμούς είναι σπάνια, ιδιαίτερα για τα είδη της Βραζιλίας.
Η δοκιμή χρόνιας τοξικότητας διήρκεσε για 168 ώρες (7 ημέρες) υπό στατικές συνθήκες και οι υποθανατηφόρες συγκεντρώσεις ήταν: 1, 3, 6 και 20 μg ai L−1. Και στα δύο πειράματα, 10 γυρίνους ανά ομάδα θεραπείας αξιολογήθηκαν με έξι επαναλήψεις, για ένα σύνολο 60 γυρίνων ανά συγκέντρωση. Εν τω μεταξύ, η θεραπεία μόνο με νερό χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος. Κάθε πειραματική διάταξη αποτελούνταν από ένα αποστειρωμένο γυάλινο δίσκο χωρητικότητας 500 ml και πυκνότητας 1 γυρίνου ανά 50 ml διαλύματος. Η φιάλη καλύφθηκε με φιλμ πολυαιθυλενίου για να αποφευχθεί η εξάτμιση και αεριζόταν συνεχώς.
Το νερό αναλύθηκε χημικά για να προσδιοριστούν οι συγκεντρώσεις φυτοφαρμάκων στις 0, 96 και 168 ώρες. Σύμφωνα με τους Sabin et al. 68 και Martins et al. 69, οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν στο Εργαστήριο Ανάλυσης Παρασιτοκτόνων (LARP) του Ομοσπονδιακού Πανεπιστημίου της Σάντα Μαρία χρησιμοποιώντας αέρια χρωματογραφία συζευγμένη με τριπλή τετραπολική φασματομετρία μάζας (Varian μοντέλο 1200, Palo Alto, Καλιφόρνια, ΗΠΑ). Ο ποσοτικός προσδιορισμός των φυτοφαρμάκων στο νερό παρουσιάζεται ως συμπληρωματικό υλικό (Πίνακας SM1).
Για τη δοκιμή μικροπυρήνων (MNT) και τη δοκιμή πυρηνικής ανωμαλίας ερυθρών αιμοσφαιρίων (RNA), αναλύθηκαν 15 γυρίνοι από κάθε ομάδα θεραπείας. Οι γυρίνοι αναισθητοποιήθηκαν με 5% λιδοκαΐνη (50 mg g-170) και συλλέχθηκαν δείγματα αίματος με καρδιακή παρακέντηση χρησιμοποιώντας ηπαρινισμένες σύριγγες μιας χρήσης. Παρασκευάστηκαν επιχρίσματα αίματος σε αποστειρωμένα πλακίδια μικροσκοπίου, ξηράνθηκαν στον αέρα, σταθεροποιήθηκαν με 100% μεθανόλη (4 °C) για 2 λεπτά και στη συνέχεια χρωματίστηκαν με διάλυμα Giemsa 10% για 15 λεπτά στο σκοτάδι. Στο τέλος της διαδικασίας, οι αντικειμενοφόρες πλάκες πλύθηκαν με απεσταγμένο νερό για να απομακρυνθεί η περίσσεια του λεκέ και ξηράνθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου.
Τουλάχιστον 1000 ερυθρά αιμοσφαίρια από κάθε γυρίνο αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο 100× με στόχο 71 για τον προσδιορισμό της παρουσίας ΜΝ και ΕΝΑ. Συνολικά 75.796 RBC από γυρίνους αξιολογήθηκαν λαμβάνοντας υπόψη τις συγκεντρώσεις κυπερμεθρίνης και τους ελέγχους. Η γονιδιοτοξικότητα αναλύθηκε σύμφωνα με τη μέθοδο των Carrasco et al. και Fenech et al.38,72 προσδιορίζοντας τη συχνότητα των ακόλουθων πυρηνικών βλαβών: (1) πυρηνοποιούν κύτταρα: κύτταρα χωρίς πυρήνες. (2) αποπτωτικά κύτταρα: πυρηνικός κατακερματισμός, προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος. (3) διπύρηνα κύτταρα: κύτταρα με δύο πυρήνες. (4) πυρηνικοί οφθαλμοί ή φυσαλίδες: κύτταρα με πυρήνες με μικρές προεξοχές της πυρηνικής μεμβράνης, φυσαλίδες παρόμοιες σε μέγεθος με μικροπυρήνες. (5) καρυολυμένα κύτταρα: κύτταρα με μόνο το περίγραμμα του πυρήνα χωρίς εσωτερικό υλικό. (6) οδοντωτά κύτταρα: κύτταρα με πυρήνες με εμφανείς ρωγμές ή εγκοπές στο σχήμα τους, που ονομάζονται επίσης πυρήνες σε σχήμα νεφρού. (7) λοβωμένα κύτταρα: κύτταρα με πυρηνικές προεξοχές μεγαλύτερες από τα προαναφερθέντα κυστίδια. και (8) μικροκύτταρα: κύτταρα με συμπυκνωμένους πυρήνες και μειωμένο κυτταρόπλασμα. Οι αλλαγές συγκρίθηκαν με τα αποτελέσματα αρνητικού ελέγχου.
Τα αποτελέσματα της δοκιμής οξείας τοξικότητας (LC50) αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GBasic και τη μέθοδο TSK-Trimmed Spearman-Karber74. Τα δεδομένα χρόνιας δοκιμής δοκιμάστηκαν εκ των προτέρων για κανονικότητα σφάλματος (Shapiro-Wilks) και ομοιογένεια διακύμανσης (Bartlett). Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA). Το τεστ Tukey χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ τους και το τεστ Dunnett χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση δεδομένων μεταξύ της ομάδας θεραπείας και της ομάδας αρνητικού ελέγχου.
Τα δεδομένα LOEC και NOEC αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τη δοκιμή Dunnett. Οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Statistica 8.0 (StatSoft) με επίπεδο σημαντικότητας 95% (ρ < 0,05).
Ώρα δημοσίευσης: Μαρ-13-2025