Η εποχιακή κατανομή των βροχοπτώσεων στην επαρχία Guizhou είναι ανομοιογενής, με περισσότερες βροχοπτώσεις την άνοιξη και το καλοκαίρι, αλλά τα σπορόφυτα ελαιοκράμβης είναι ευάλωτα στην ξηρασία το φθινόπωρο και τον χειμώνα, γεγονός που επηρεάζει σοβαρά την απόδοση. Η μουστάρδα είναι μια ειδική καλλιέργεια ελαιούχων σπόρων που καλλιεργείται κυρίως στην επαρχία Guizhou. Έχει ισχυρή ανοχή στην ξηρασία και μπορεί να καλλιεργηθεί σε ορεινές περιοχές. Είναι μια πλούσια πηγή γονιδίων ανθεκτικών στην ξηρασία. Η ανακάλυψη γονιδίων ανθεκτικών στην ξηρασία είναι κρίσιμης σημασίας για τη βελτίωση των ποικιλιών μουστάρδας και την καινοτομία στους πόρους γενετικού υλικού. Η οικογένεια GRF παίζει κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη και την ανάπτυξη των φυτών και στην αντίδραση στο στρες της ξηρασίας. Προς το παρόν, γονίδια GRF έχουν βρεθεί στο Arabidopsis 2, στο ρύζι (Oryza sativa) 12, στο ελαιοκράμβη 13, στο βαμβάκι (Gossypium hirsutum) 14, στο σιτάρι (Triticum aestivum) 15, στο κεχρί (Setaria italica) 16 και στο Brassica 17, αλλά δεν υπάρχουν αναφορές για ανίχνευση γονιδίων GRF στη μουστάρδα. Σε αυτή τη μελέτη, τα γονίδια της οικογένειας GRF της μουστάρδας ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο ολόκληρου του γονιδιώματος και αναλύθηκαν τα φυσικά και χημικά χαρακτηριστικά τους, οι εξελικτικές σχέσεις, η ομολογία, τα διατηρημένα μοτίβα, η δομή των γονιδίων, οι διπλασιασμοί γονιδίων, τα cis-στοιχεία και το στάδιο των σπορόφυτων (στάδιο τεσσάρων φύλλων). Τα πρότυπα έκφρασης υπό στρες ξηρασίας αναλύθηκαν διεξοδικά για να παρέχουν μια επιστημονική βάση για περαιτέρω μελέτες σχετικά με την πιθανή λειτουργία των γονιδίων BjGRF στην απόκριση στην ξηρασία και για να παρέχουν υποψήφια γονίδια για την αναπαραγωγή μουστάρδας ανθεκτικής στην ξηρασία.
Τριάντα τέσσερα γονίδια BjGRF ταυτοποιήθηκαν στο γονιδίωμα του Brassica juncea χρησιμοποιώντας δύο αναζητήσεις HMMER, οι οποίες όλες περιέχουν τους τομείς QLQ και WRC. Οι αλληλουχίες CDS των ταυτοποιημένων γονιδίων BjGRF παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S1. Τα BjGRF01–BjGRF34 ονομάζονται με βάση τη θέση τους στο χρωμόσωμα. Οι φυσικοχημικές ιδιότητες αυτής της οικογένειας υποδεικνύουν ότι το μήκος των αμινοξέων είναι ιδιαίτερα μεταβλητό, κυμαινόμενο από 261 aa (BjGRF19) έως 905 aa (BjGRF28). Το ισοηλεκτρικό σημείο του BjGRF κυμαίνεται από 6,19 (BjGRF02) έως 9,35 (BjGRF03) με μέσο όρο 8,33, και το 88,24% του BjGRF είναι μια βασική πρωτεΐνη. Το προβλεπόμενο εύρος μοριακού βάρους του BjGRF είναι από 29,82 kDa (BjGRF19) έως 102,90 kDa (BjGRF28). Ο δείκτης αστάθειας των πρωτεϊνών BjGRF κυμαίνεται από 51,13 (BjGRF08) έως 78,24 (BjGRF19), όλες είναι μεγαλύτερες από 40, υποδεικνύοντας ότι ο δείκτης λιπαρών οξέων κυμαίνεται από 43,65 (BjGRF01) έως 78,78 (BjGRF22), η μέση υδροφιλικότητα (GRAVY) κυμαίνεται από -1,07 (BjGRF31) έως -0,45 (BjGRF22), όλες οι υδρόφιλες πρωτεΐνες BjGRF έχουν αρνητικές τιμές GRAVY, οι οποίες μπορεί να οφείλονται στην έλλειψη υδροφοβικότητας που προκαλείται από τα υπολείμματα. Η πρόβλεψη υποκυτταρικής εντόπισης έδειξε ότι 31 πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από BjGRF θα μπορούσαν να εντοπιστούν στον πυρήνα, η BjGRF04 θα μπορούσε να εντοπιστεί σε υπεροξυσώματα, η BjGRF25 θα μπορούσε να εντοπιστεί στο κυτταρόπλασμα και η BjGRF28 θα μπορούσε να εντοπιστεί σε χλωροπλάστες (Πίνακας 1), υποδεικνύοντας ότι οι BjGRFs μπορεί να εντοπίζονται στον πυρήνα και να παίζουν σημαντικό ρυθμιστικό ρόλο ως μεταγραφικός παράγοντας.
Η φυλογενετική ανάλυση των οικογενειών GRF σε διαφορετικά είδη μπορεί να βοηθήσει στη μελέτη των γονιδιακών λειτουργιών. Επομένως, κατεβάστηκαν οι αλληλουχίες αμινοξέων πλήρους μήκους 35 GRF από ελαιοκράμβη, 16 από γογγύλια, 12 από ρύζι, 10 από κεχρί και 9 από Arabidopsis και κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση 34 ταυτοποιημένα γονίδια BjGRF (Εικ. 1). Οι τρεις υποοικογένειες περιέχουν διαφορετικούς αριθμούς μελών. 116 GRF TFs χωρίζονται σε τρεις διαφορετικές υποοικογένειες (ομάδες A~C), που περιέχουν 59 (50,86%), 34 (29,31%) και 23 (19,83)% των GRF, αντίστοιχα. Μεταξύ αυτών, 34 μέλη της οικογένειας BjGRF είναι διασκορπισμένα σε 3 υποοικογένειες: 13 μέλη στην ομάδα Α (38,24%), 12 μέλη στην ομάδα Β (35,29%) και 9 μέλη στην ομάδα C (26,47%). Κατά τη διαδικασία της πολυπλοειδοποίησης της μουστάρδας, ο αριθμός των γονιδίων BjGRFs σε διαφορετικές υποοικογένειες είναι διαφορετικός και ενδέχεται να έχει συμβεί ενίσχυση και απώλεια γονιδίων. Αξίζει να σημειωθεί ότι δεν υπάρχει κατανομή των GRFs ρυζιού και κεχρί στην ομάδα C, ενώ υπάρχουν 2 GRFs ρυζιού και 1 GRF κεχρί στην ομάδα B, και τα περισσότερα GRFs ρυζιού και κεχρί ομαδοποιούνται σε έναν κλάδο, υποδεικνύοντας ότι τα BjGRFs σχετίζονται στενά με τα δικοτυλήδονα. Μεταξύ αυτών, οι πιο εμπεριστατωμένες μελέτες σχετικά με τη λειτουργία του GRF στο Arabidopsis thaliana παρέχουν τη βάση για λειτουργικές μελέτες των BjGRFs.
Φυλογενετικό δέντρο της σιναπιού που περιλαμβάνει τα Brassica napus, Brassica napus, ρύζι, κεχρί και μέλη της οικογένειας Arabidopsis thaliana GRF.
Ανάλυση επαναλαμβανόμενων γονιδίων στην οικογένεια GRF μουστάρδας. Η γκρι γραμμή στο φόντο αντιπροσωπεύει ένα συγχρονισμένο μπλοκ στο γονιδίωμα μουστάρδας, η κόκκινη γραμμή αντιπροσωπεύει ένα ζεύγος τμηματοποιημένων επαναλήψεων του γονιδίου BjGRF.
Έκφραση γονιδίου BjGRF υπό στρες ξηρασίας στο στάδιο του τέταρτου φύλλου. Τα δεδομένα qRT-PCR παρουσιάζονται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S5. Οι σημαντικές διαφορές στα δεδομένα υποδεικνύονται με πεζά γράμματα.
Καθώς το παγκόσμιο κλίμα συνεχίζει να αλλάζει, η μελέτη του τρόπου με τον οποίο οι καλλιέργειες αντιμετωπίζουν το στρες της ξηρασίας και η βελτίωση των μηχανισμών ανοχής τους έχει γίνει ένα καυτό ερευνητικό θέμα18. Μετά την ξηρασία, η μορφολογική δομή, η γονιδιακή έκφραση και οι μεταβολικές διεργασίες των φυτών θα αλλάξουν, γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στην παύση της φωτοσύνθεσης και σε μεταβολικές διαταραχές, επηρεάζοντας την απόδοση και την ποιότητα των καλλιεργειών19,20,21. Όταν τα φυτά αντιλαμβάνονται σήματα ξηρασίας, παράγουν δεύτερους αγγελιοφόρους όπως Ca2+ και φωσφατιδυλινοσιτόλη, αυξάνουν την ενδοκυτταρική συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου και ενεργοποιούν το ρυθμιστικό δίκτυο της οδού φωσφορυλίωσης πρωτεϊνών22,23. Η τελική πρωτεΐνη-στόχος εμπλέκεται άμεσα στην κυτταρική άμυνα ή ρυθμίζει την έκφραση σχετικών γονιδίων στρες μέσω TFs, ενισχύοντας την ανοχή των φυτών στο στρες24,25. Έτσι, οι TFs παίζουν κρίσιμο ρόλο στην απόκριση στο στρες της ξηρασίας. Σύμφωνα με την αλληλουχία και τις ιδιότητες σύνδεσης DNA των TFs που ανταποκρίνονται στο στρες της ξηρασίας, οι TFs μπορούν να χωριστούν σε διαφορετικές οικογένειες, όπως GRF, ERF, MYB, WRKY και άλλες οικογένειες26.
Η οικογένεια γονιδίων GRF είναι ένας τύπος φυτικού TF που παίζει σημαντικό ρόλο σε διάφορες πτυχές όπως η ανάπτυξη, η εξέλιξη, η μεταγωγή σήματος και οι αμυντικές αποκρίσεις των φυτών27. Από τότε που αναγνωρίστηκε το πρώτο γονίδιο GRF στο O. sativa28, όλο και περισσότερα γονίδια GRF έχουν αναγνωριστεί σε πολλά είδη και έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν την ανάπτυξη, την ανάπτυξη και την απόκριση στο στρες των φυτών8, 29, 30,31,32. Με τη δημοσίευση της αλληλουχίας του γονιδιώματος Brassica juncea, κατέστη δυνατή η αναγνώριση της οικογένειας γονιδίων BjGRF33. Σε αυτή τη μελέτη, αναγνωρίστηκαν 34 γονίδια BjGRF σε ολόκληρο το γονιδίωμα της μουστάρδας και ονομάστηκαν BjGRF01–BjGRF34 με βάση τη χρωμοσωμική τους θέση. Όλα αυτά περιέχουν εξαιρετικά συντηρημένες περιοχές QLQ και WRC. Η ανάλυση των φυσικοχημικών ιδιοτήτων έδειξε ότι οι διαφορές στον αριθμό αμινοξέων και τα μοριακά βάρη των πρωτεϊνών BjGRF (εκτός από την BjGRF28) δεν ήταν σημαντικές, υποδεικνύοντας ότι τα μέλη της οικογένειας BjGRF μπορεί να έχουν παρόμοιες λειτουργίες. Η ανάλυση της γονιδιακής δομής έδειξε ότι το 64,7% των γονιδίων BjGRF περιείχε 4 εξόνια, υποδεικνύοντας ότι η δομή του γονιδίου BjGRF είναι σχετικά διατηρημένη κατά την εξέλιξη, αλλά ο αριθμός των εξονίων στα γονίδια BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 και BjGRF29 είναι μεγαλύτερος. Μελέτες έχουν δείξει ότι η προσθήκη ή η διαγραφή εξονίων ή ιντρονίων μπορεί να οδηγήσει σε διαφορές στη δομή και τη λειτουργία των γονιδίων, δημιουργώντας έτσι νέα γονίδια34,35,36. Επομένως, εικάζουμε ότι το ιντρόνιο του BjGRF χάθηκε κατά την εξέλιξη, γεγονός που μπορεί να προκαλέσει αλλαγές στη γονιδιακή λειτουργία. Σε συμφωνία με τις υπάρχουσες μελέτες, διαπιστώσαμε επίσης ότι ο αριθμός των ιντρονίων συσχετίστηκε με την γονιδιακή έκφραση. Όταν ο αριθμός των ιντρονίων σε ένα γονίδιο είναι μεγάλος, το γονίδιο μπορεί να ανταποκριθεί γρήγορα σε διάφορους δυσμενείς παράγοντες.
Ο διπλασιασμός των γονιδίων αποτελεί σημαντικό παράγοντα στη γονιδιωματική και γενετική εξέλιξη37. Σχετικές μελέτες έχουν δείξει ότι ο διπλασιασμός των γονιδίων όχι μόνο αυξάνει τον αριθμό των γονιδίων GRF, αλλά χρησιμεύει επίσης ως μέσο δημιουργίας νέων γονιδίων που βοηθούν τα φυτά να προσαρμοστούν σε διάφορες δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες38. Συνολικά 48 διπλά ζεύγη γονιδίων βρέθηκαν σε αυτή τη μελέτη, όλα εκ των οποίων ήταν τμηματικοί διπλασιασμοί, υποδεικνύοντας ότι οι τμηματικοί διπλασιασμοί είναι ο κύριος μηχανισμός για την αύξηση του αριθμού των γονιδίων σε αυτήν την οικογένεια. Έχει αναφερθεί στη βιβλιογραφία ότι ο τμηματικός διπλασιασμός μπορεί να προωθήσει αποτελεσματικά την ενίσχυση των μελών της οικογένειας γονιδίων GRF στο Arabidopsis και τη φράουλα, και δεν βρέθηκε διαδοχικός διπλασιασμός αυτής της οικογένειας γονιδίων σε κανένα από τα είδη27,39. Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης είναι σύμφωνα με τις υπάρχουσες μελέτες για τις οικογένειες Arabidopsis thaliana και φράουλας, υποδηλώνοντας ότι η οικογένεια GRF μπορεί να αυξήσει τον αριθμό των γονιδίων και να δημιουργήσει νέα γονίδια μέσω τμηματικού διπλασιασμού σε διαφορετικά φυτά.
Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίστηκαν συνολικά 34 γονίδια BjGRF στη μουστάρδα, τα οποία χωρίστηκαν σε 3 υποοικογένειες. Αυτά τα γονίδια έδειξαν παρόμοια διατηρημένα μοτίβα και δομές γονιδίων. Η ανάλυση συγγραμμικότητας αποκάλυψε 48 ζεύγη διπλασιασμών τμημάτων στη μουστάρδα. Η περιοχή υποκινητή BjGRF περιέχει cis-δρώντα στοιχεία που σχετίζονται με την απόκριση στο φως, την ορμονική απόκριση, την απόκριση στο περιβαλλοντικό στρες και την ανάπτυξη. Η έκφραση 34 γονιδίων BjGRF ανιχνεύθηκε στο στάδιο των σπορόφυτων μουστάρδας (ρίζες, μίσχοι, φύλλα) και το πρότυπο έκφρασης 10 γονιδίων BjGRF υπό συνθήκες ξηρασίας. Διαπιστώθηκε ότι τα πρότυπα έκφρασης των γονιδίων BjGRF υπό στρες ξηρασίας ήταν παρόμοια και μπορεί να είναι παρόμοια.
Οι σπόροι μουστάρδας που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτό το πείραμα παρέχονταν από το Ινστιτούτο Έρευνας Ελαιούχων Σπόρων Guizhou, Ακαδημία Γεωργικών Επιστημών Guizhou. Επιλέξατε ολόκληρους σπόρους και φυτέψτε τους στο έδαφος (υπόστρωμα: έδαφος = 3:1) και συλλέξτε τις ρίζες, τους μίσχους και τα φύλλα μετά το στάδιο των τεσσάρων φύλλων. Τα φυτά υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 20% PEG 6000 για προσομοίωση ξηρασίας και τα φύλλα συλλέχθηκαν μετά από 0, 3, 6, 12 και 24 ώρες. Όλα τα δείγματα φυτών καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν σε καταψύκτη στους -80°C για την επόμενη δοκιμή.
Όλα τα δεδομένα που ελήφθησαν ή αναλύθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής της μελέτης περιλαμβάνονται στο δημοσιευμένο άρθρο και στα συμπληρωματικά αρχεία πληροφοριών.
Ώρα δημοσίευσης: 22 Ιανουαρίου 2025