Φυτικά και παθογόνα υλικά
Ένας πληθυσμός χαρτογράφησης συσχέτισης σόργου, γνωστός ως πληθυσμός μετατροπής σόργου (SCP), παρείχε ο Δρ. Pat Brown στο Πανεπιστήμιο του Ιλινόις (τώρα στο UC Davis). Έχει περιγραφεί προηγουμένως και είναι μια συλλογή από ποικίλες σειρές που έχουν μετατραπεί σε μη ευαισθησία στη φωτοπερίοδο και μικρότερο ανάστημα για να διευκολυνθεί η ανάπτυξη και η εξέλιξη των φυτών σε περιβάλλοντα των ΗΠΑ. 510 σειρές από αυτόν τον πληθυσμό χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, αν και λόγω κακής βλάστησης και άλλων ζητημάτων ποιοτικού ελέγχου, δεν χρησιμοποιήθηκαν όλες οι σειρές στην ανάλυση και των τριών χαρακτηριστικών. Τελικά, δεδομένα από 345 σειρές χρησιμοποιήθηκαν για την ανάλυση της απόκρισης στη χιτίνη, 472 γραμμές για την απόκριση flg22 και 456 για την αντοχή στο TLS.Β. cookeiΤο στέλεχος LSLP18 ελήφθη από τον Δρ. Burt Bluhm στο Πανεπιστήμιο του Αρκάνσας.
Μέτρηση απόκρισης MAMP
Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν δύο διαφορετικά MAMPs, το flg22 (κατάλογος Genscript # RP19986), και η χιτίνη. Τα φυτά σόργου αναπτύχθηκαν σε ένθετα τοποθετημένα σε επίπεδα γεμάτα με χώμα (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) στο θερμοκήπιο. Τα φυτά ποτίστηκαν την ημέρα πριν από τη συλλογή του δείγματος για να αποφευχθεί η επιπλέον υγρασία των φύλλων την ημέρα της συλλογής.
Οι σειρές τυχαιοποιήθηκαν και, για λόγους υλικοτεχνικής υποστήριξης, φυτεύτηκαν σε παρτίδες των 60 γραμμών. Για κάθε σειρά, φυτεύτηκαν τρεις «γλάστρες» με δύο σπόρους ανά σειρά. Οι επόμενες παρτίδες φυτεύτηκαν μόλις η προηγούμενη παρτίδα είχε υποβληθεί σε επεξεργασία μέχρι να αξιολογηθεί ολόκληρος ο πληθυσμός. Διεξήχθησαν δύο πειραματικές δοκιμές και για τα δύο MAMPs με γονότυπους που επανατυχαιοποιήθηκαν σε καθεμία από τις δύο δοκιμές.
Οι δοκιμασίες ROS πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, για κάθε γραμμή, έξι σπόροι φυτεύτηκαν σε 3 διαφορετικές γλάστρες. Από τα σπορόφυτα που προέκυψαν, επιλέχθηκαν τρία με βάση την ομοιομορφία. Δεν χρησιμοποιήθηκαν σπορόφυτα που φαίνονταν ασυνήθιστα ή ήταν σημαντικά ψηλότερα ή κοντύτερα από την πλειοψηφία. Τέσσερις δίσκοι φύλλων διαμέτρου 3 mm αφαιρέθηκαν από το ευρύτερο μέρος του 4ου φύλλου τριών διαφορετικών φυτών σόργου ηλικίας 15 ημερών. Ένας δίσκος ανά φύλλο από δύο φυτά και δύο δίσκοι από ένα φυτό, με τον δεύτερο δίσκο να γίνεται ο έλεγχος νερού (βλ. παρακάτω). Οι δίσκοι επιπλεύθηκαν ξεχωριστά σε 50 µl H2O σε μια μαύρη πλάκα 96 φρεατίων, σφραγίστηκαν με σφράγιση αλουμινίου για να αποφευχθεί η έκθεση στο φως και διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου όλη τη νύχτα. Το επόμενο πρωί παρασκευάστηκε ένα διάλυμα αντίδρασης χρησιμοποιώντας 2 mg/ml χημειοφωταυγή ανιχνευτή L-012 (Wako, αρ. καταλόγου 120-04891), 2 mg/ml υπεροξειδάση χρένου (Τύπος VI-A, Sigma-Aldrich, αρ. καταλόγου P6782) και 100 mg/ml χιτίνη ή 2 μM Flg22. 50 μl αυτού του διαλύματος αντίδρασης προστέθηκαν σε τρία από τα τέσσερα φρεάτια. Το τέταρτο φρεάτιο ήταν ένας εικονικός έλεγχος, στον οποίο προστέθηκε το διάλυμα αντίδρασης χωρίς το MAMP. Τέσσερα κενά φρεάτια που περιείχαν μόνο νερό συμπεριλήφθηκαν επίσης σε κάθε πλάκα.
Μετά την προσθήκη του διαλύματος αντίδρασης, η φωταύγεια μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη συσκευή ανάγνωσης μικροπλακών πολλαπλών ανιχνεύσεων SynergyTM 2 (BioTek) κάθε 2 λεπτά για 1 ώρα. Η συσκευή ανάγνωσης πλακών λαμβάνει μετρήσεις φωταύγειας κάθε 2 λεπτά κατά τη διάρκεια αυτής της 1 ώρας. Το άθροισμα και των 31 μετρήσεων υπολογίστηκε για να δώσει την τιμή για κάθε φρεάτιο. Η εκτιμώμενη τιμή για την απόκριση MAMP για κάθε γονότυπο υπολογίστηκε ως (μέση τιμή φωταύγειας των τριών πειραματικών φρεατίων - η τιμή εικονικού φρεατίου) - μείον τη μέση τιμή του τυφλού φρεατίου. Οι τιμές του τυφλού φρεατίου ήταν σταθερά κοντά στο μηδέν.
Δίσκοι φύλλων απόΝικοτιανή μπενταμιανή, μία γραμμή σόργου υψηλής απόκρισης (SC0003) και μία γραμμή σόργου χαμηλής απόκρισης (PI 6069) συμπεριλήφθηκαν επίσης ως έλεγχοι σε κάθε πλάκα 96 φρεατίων για σκοπούς ποιοτικού ελέγχου.
Β. cookeiπροετοιμασία και εμβολιασμός εμβολίου
Β. cookeiΤο εμβόλιο παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Εν συντομία, οι κόκκοι σόργου μουλιάστηκαν σε νερό για τρεις ημέρες, ξεπλύθηκαν, τοποθετήθηκαν σε κωνικές φιάλες του 1 λίτρου και αποστειρώθηκαν σε αυτόκλειστο για μία ώρα στα 15 psi και στους 121 °C. Στη συνέχεια, οι κόκκοι εμβολιάστηκαν με περίπου 5 ml εμποτισμένων μυκηλίων από μια φρέσκια καλλιέργειαΒ. cookeiΑπομονώθηκαν τα στελέχη LSLP18 και αφέθηκαν για 2 εβδομάδες σε θερμοκρασία δωματίου, ανακινώντας τις φιάλες κάθε 3 ημέρες. Μετά από 2 εβδομάδες, οι μολυσμένοι με μύκητες κόκκοι σόργου ξηράνθηκαν στον αέρα και στη συνέχεια αποθηκεύτηκαν στους 4 °C μέχρι τον εμβολιασμό στο πεδίο. Το ίδιο εμβόλιο χρησιμοποιήθηκε για ολόκληρη τη δοκιμή και παρασκευαζόταν φρέσκο κάθε χρόνο. Για τον εμβολιασμό, 6-10 μολυσμένοι κόκκοι τοποθετήθηκαν στον κύλινδρο φυτών σόργου ηλικίας 4-5 εβδομάδων. Τα σπόρια που παράγονται από αυτούς τους μύκητες ξεκίνησαν τη μόλυνση στα νεαρά φυτά σόργου εντός μιας εβδομάδας.
Προετοιμασία σπόρων
Πριν από τη φύτευση στο χωράφι, οι σπόροι σόργου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα μείγμα μυκητοκτόνου, εντομοκτόνου και προστατευτικού που περιείχε ~ 1% μυκητοκτόνο Spirato 480 FS, 4% μυκητοκτόνο Sebring 480 FS, 3% προστατευτικό σπόρων Sorpro 940 ES. Στη συνέχεια, οι σπόροι ξηράνθηκαν στον αέρα για 3 ημέρες, γεγονός που παρείχε μια λεπτή επικάλυψη αυτού του μείγματος γύρω από τους σπόρους. Το προστατευτικό επέτρεψε τη χρήση του ζιζανιοκτόνου Dual Magnum ως προφυτρωτική επεξεργασία.
Αξιολόγηση της αντοχής στην κηλίδωση των φύλλων-στόχων
Το SCP φυτεύτηκε στον Κεντρικό Σταθμό Έρευνας Καλλιεργειών στο Clayton, NC στις 14-15 Ιουνίου 2017 και στις 20 Ιουνίου 2018 σε τυχαιοποιημένο σχεδιασμό πλήρους μπλοκ με δύο πειραματικές επαναλήψεις σε κάθε περίπτωση. Τα πειράματα φυτεύτηκαν σε μονές σειρές 1,8 m με πλάτος σειράς 0,9 m χρησιμοποιώντας 10 σπόρους ανά αγροτεμάχιο. Δύο σειρές ορίων φυτεύτηκαν γύρω από την περιφέρεια κάθε πειράματος για την αποφυγή φαινομένων στις άκρες. Τα πειράματα εμβολιάστηκαν στις 20 Ιουλίου 2017 και 20 Ιουλίου 2018, οπότε τα φυτά σόργου βρίσκονταν στο στάδιο ανάπτυξης 3. Οι αξιολογήσεις ελήφθησαν σε κλίμακες από το ένα έως το εννέα, όπου τα φυτά που δεν εμφάνιζαν σημάδια ασθένειας βαθμολογήθηκαν με εννέα και τα εντελώς νεκρά φυτά βαθμολογήθηκαν με ένα. Δύο αξιολογήσεις ελήφθησαν το 2017 και τέσσερις μετρήσεις το 2018 ξεκινώντας δύο εβδομάδες μετά τον εμβολιασμό κάθε χρόνο. Η sAUDPC (τυποποιημένη περιοχή κάτω από την καμπύλη εξέλιξης της ασθένειας) υπολογίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως.
Ώρα δημοσίευσης: 01 Απριλίου 2021