Ο νηματώδης πεύκου είναι ένα μεταναστευτικό ενδοπαράσιτο καραντίνας που είναι γνωστό ότι προκαλεί σοβαρές οικονομικές απώλειες σε οικοσυστήματα πευκοδάσους. Η παρούσα μελέτη εξετάζει τη νηματοκτόνο δράση των αλογονωμένων ινδολίων έναντι των νηματωδών πεύκου και τον μηχανισμό δράσης τους. Οι νηματοκτόνοι δράσεις της 5-ιωδοϊνδόλης και της αβερμεκτίνης (θετικός έλεγχος) έναντι των νηματωδών πεύκου ήταν παρόμοιες και υψηλές σε χαμηλές συγκεντρώσεις (10 μg/mL). Η 5-ιωδοϊνδόλη μείωσε τη γονιμότητα, την αναπαραγωγική δραστηριότητα, την εμβρυϊκή και προνυμφική θνησιμότητα, καθώς και την κινητική συμπεριφορά. Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις των υποδοχέων με τους ειδικούς για τα ασπόνδυλα υποδοχείς καναλιών χλωρίου που ελέγχονται από το γλουταμινικό υποστηρίζουν την άποψη ότι η 5-ιωδοϊνδόλη, όπως και η αβερμεκτίνη, συνδέεται στενά με την ενεργό θέση του υποδοχέα. Η 5-ιωδοϊνδόλη προκάλεσε επίσης διάφορες φαινοτυπικές παραμορφώσεις στα νηματώδη, συμπεριλαμβανομένης της ανώμαλης κατάρρευσης/συρρίκνωσης οργάνων και της αυξημένης κενοτοπίωσης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κενοτόπια μπορεί να παίζουν ρόλο στον θάνατο που προκαλείται από μεθυλίωση των νηματωδών. Είναι σημαντικό ότι η 5-ιωδοϊνδόλη δεν ήταν τοξική και για τα δύο είδη φυτών (λάχανο και ραπανάκι). Έτσι, αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η εφαρμογή ιωδοϊνδόλης υπό περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να ελέγξει τη βλάβη από μαρασμό του πεύκου.
Ο νηματώδης του πεύκου (Bursaphelenchus xylophilus) ανήκει στα νηματώδη του πεύκου (PWN), μεταναστευτικά ενδοπαρασιτικά νηματώδη που είναι γνωστό ότι προκαλούν σοβαρές οικολογικές ζημιές στα οικοσυστήματα των πευκοδάσων1. Η νόσος του μαρασμού των πεύκων (PWD) που προκαλείται από τον νηματώδη του πεύκου γίνεται σοβαρό πρόβλημα σε αρκετές ηπείρους, συμπεριλαμβανομένης της Ασίας και της Ευρώπης, και στη Βόρεια Αμερική, ο νηματώδης καταστρέφει τα εισαγόμενα είδη πεύκων1,2. Η μείωση των πεύκων αποτελεί σημαντικό οικονομικό πρόβλημα και η προοπτική της παγκόσμιας εξάπλωσής της είναι ανησυχητική3. Τα ακόλουθα είδη πεύκων δέχονται συχνότερα επίθεση από τον νηματώδη: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii και Pinus radiata4. Ο νηματώδης του πεύκου είναι μια σοβαρή ασθένεια που μπορεί να σκοτώσει τα πεύκα μέσα σε εβδομάδες ή μήνες από τη μόλυνση. Επιπλέον, οι επιδημίες νηματωδών των πεύκων είναι συχνές σε μια ποικιλία οικοσυστημάτων, επομένως έχουν δημιουργηθεί επίμονες αλυσίδες μόλυνσης1.
Ο Bursaphelenchus xylophilus είναι ένας νηματώδης καραντίνας που παρασιτίζει τα φυτά και ανήκει στην υπεροικογένεια Aphelenchoidea και στον κλάδο 102.5. Ο νηματώδης τρέφεται με μύκητες και αναπαράγεται στους ξυλώδεις ιστούς των πεύκων, αναπτύσσοντας τέσσερα διαφορετικά προνυμφικά στάδια: L1, L2, L3, L4 και ένα ενήλικο άτομο1,6. Υπό συνθήκες έλλειψης τροφής, ο νηματώδης πεύκου περνάει σε ένα εξειδικευμένο προνυμφικό στάδιο - dauer, το οποίο παρασιτίζει τον φορέα του - το σκαθάρι του φλοιού του πεύκου (Monochamus alternatus) και μεταφέρεται σε υγιή πεύκα. Σε υγιείς ξενιστές, τα νηματώδη μεταναστεύουν γρήγορα μέσω των φυτικών ιστών και τρέφονται με παρεγχυματικά κύτταρα, γεγονός που οδηγεί σε μια σειρά αντιδράσεων υπερευαισθησίας, μαρασμό του πεύκου και θάνατο εντός ενός έτους από τη μόλυνση1,7,8.
Ο βιολογικός έλεγχος των νηματωδών πεύκου αποτελεί εδώ και καιρό μια πρόκληση, με μέτρα καραντίνας που χρονολογούνται από τον 20ό αιώνα. Οι τρέχουσες στρατηγικές για τον έλεγχο των νηματωδών πεύκου περιλαμβάνουν κυρίως χημικές επεξεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του υποκαπνισμού ξύλου και της εμφύτευσης νηματωδοκτόνων σε κορμούς δέντρων. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα νηματωδοκτόνα είναι η αβερμεκτίνη και η βενζοϊκή αβερμεκτίνη, τα οποία ανήκουν στην οικογένεια των αβερμεκτινών. Αυτές οι ακριβές χημικές ουσίες είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές έναντι πολλών ειδών νηματωδών και θεωρούνται περιβαλλοντικά ασφαλείς9. Ωστόσο, η επαναλαμβανόμενη χρήση αυτών των νηματωδών αναμένεται να δημιουργήσει πίεση επιλογής που σχεδόν σίγουρα θα οδηγήσει στην εμφάνιση ανθεκτικών νηματωδών πεύκου, όπως έχει αποδειχθεί για πολλά έντομα παράσιτα, όπως τα Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella και τα νηματώδη Trichostrongylus colubriformis και Ostertagia circumcincta, τα οποία έχουν σταδιακά αναπτύξει αντοχή στις αβερμεκτίνες10,11,12. Επομένως, τα πρότυπα αντοχής πρέπει να μελετώνται τακτικά και τα νηματωδοκτόνα να ελέγχονται συνεχώς για την εύρεση εναλλακτικών, οικονομικά αποδοτικών και φιλικών προς το περιβάλλον μέτρων για τον έλεγχο της PVD. Τις τελευταίες δεκαετίες, αρκετοί συγγραφείς έχουν προτείνει τη χρήση φυτικών εκχυλισμάτων, αιθέριων ελαίων και πτητικών ουσιών ως παράγοντες ελέγχου νηματωδών13,14,15,16.
Πρόσφατα καταδείξαμε την νηματοκτόνο δράση της ινδόλης, ενός μεσοκυττάριου και διαβασιλικού σηματοδοτικού μορίου, στο Caenorhabditis elegans 17. Η ινδόλη είναι ένα ευρέως διαδεδομένο ενδοκυτταρικό σήμα στην μικροβιακή οικολογία, ελέγχοντας πολυάριθμες λειτουργίες που επηρεάζουν τη μικροβιακή φυσιολογία, τον σχηματισμό σπορίων, τη σταθερότητα των πλασμιδίων, την αντοχή στα φάρμακα, τον σχηματισμό βιοφίλμ και τη λοιμογόνο δράση 18, 19. Η δράση της ινδόλης και των παραγώγων της έναντι άλλων παθογόνων νηματωδών δεν έχει μελετηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη νηματοκτόνο δράση 34 ινδολών έναντι των νηματωδών πεύκου και διευκρινίσαμε τον μηχανισμό δράσης της πιο ισχυρής 5-ιωδοϊνδόλης χρησιμοποιώντας μικροσκοπία, φωτογραφία με χρονική καθυστέρηση και πειράματα μοριακής σύνδεσης, και αξιολογήσαμε τις τοξικές της επιδράσεις στα φυτά χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία βλάστησης σπόρων.
Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι υψηλές συγκεντρώσεις (>1,0 mM) ινδόλης έχουν νηματοκτονική δράση στα νηματώδη17. Μετά την επεξεργασία του B. xylophilus (μικτά στάδια ζωής) με ινδόλη ή 33 διαφορετικά παράγωγα ινδόλης στο 1 mM, η θνησιμότητα του B. xylophilus μετρήθηκε μετρώντας τα ζωντανά και νεκρά νηματώδη στις ομάδες ελέγχου και στις ομάδες που υποβλήθηκαν σε αγωγή. Πέντε ινδόλες εμφάνισαν σημαντική νηματοκτονική δράση. Η επιβίωση της ομάδας ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε αγωγή ήταν 95 ± 7% μετά από 24 ώρες. Από τις 34 ινδόλες που εξετάστηκαν, η 5-ιωδοϊνδόλη και η 4-φθοροϊνδόλη στο 1 mM προκάλεσαν 100% θνησιμότητα, ενώ η 5,6-διφθοροϊνδιγο, η μεθυλινδόλη-7-καρβοξυλική και η 7-ιωδοϊνδόλη προκάλεσαν περίπου 50% θνησιμότητα (Πίνακας 1).
Επίδραση της 5-ιωδοϊνδόλης στον σχηματισμό κενοτοπίων και τον μεταβολισμό του νηματώδους πεύκου. (Α) Επίδραση της αβερμεκτίνης και της 5-ιωδοϊνδόλης σε ενήλικα αρσενικά νηματώδη, (Β) αυγά νηματωδών σταδίου L1 και (Γ) μεταβολισμός του B. xylophilus, (i) δεν παρατηρήθηκαν κενοτόπια στις 0 ώρες, η θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα (ii) κενοτόπια, (iii) συσσώρευση πολλαπλών κενοτοπίων, (iv) διόγκωση κενοτοπίων, (v) σύντηξη κενοτοπίων και (vi) σχηματισμό γιγαντιαίων κενοτοπίων. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν διόγκωση κενοτοπίων, τα μπλε βέλη υποδεικνύουν σύντηξη κενοτοπίων και τα μαύρα βέλη υποδεικνύουν γιγαντιαία κενοτόπια. Γραμμή κλίμακας = 50 μm.
Επιπλέον, αυτή η μελέτη περιέγραψε επίσης τη διαδοχική διαδικασία θανάτου που προκαλείται από μεθάνιο σε νηματώδη πεύκου (Σχήμα 4C). Ο μεθανογενής θάνατος είναι ένας μη αποπτωτικός τύπος κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με τη συσσώρευση εμφανών κυτταροπλασματικών κενοτοπίων27. Τα μορφολογικά ελαττώματα που παρατηρούνται σε νηματώδη πεύκου φαίνεται να σχετίζονται στενά με τον μηχανισμό θανάτου που προκαλείται από μεθάνιο. Η μικροσκοπική εξέταση σε διαφορετικές χρονικές στιγμές έδειξε ότι σχηματίστηκαν γιγάντια κενοτόπια μετά από 20 ώρες έκθεσης σε 5-ιωδοϊνδόλη (0,1 mM). Μικροσκοπικά κενοτόπια παρατηρήθηκαν μετά από 8 ώρες θεραπείας και ο αριθμός τους αυξήθηκε μετά από 12 ώρες. Αρκετά μεγάλα κενοτόπια παρατηρήθηκαν μετά από 14 ώρες. Αρκετά συγχωνευμένα κενοτόπια ήταν σαφώς ορατά μετά από 12-16 ώρες θεραπείας, υποδεικνύοντας ότι η σύντηξη κενοτοπίων είναι η βάση του μηχανισμού μεθανογενούς θανάτου. Μετά από 20 ώρες, βρέθηκαν αρκετά γιγάντια κενοτόπια σε όλο το σκουλήκι. Αυτές οι παρατηρήσεις αντιπροσωπεύουν την πρώτη αναφορά μετάπτωσης στο C. elegans.
Σε σκώληκες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη, παρατηρήθηκε επίσης συσσωμάτωση και ρήξη κενοτοπίων (Εικ. 5), όπως αποδεικνύεται από την κάμψη του σκουληκιού και την απελευθέρωση κενοτοπίων στο περιβάλλον. Διαταραχή κενοτοπίων παρατηρήθηκε επίσης στη μεμβράνη του κελύφους του αυγού, η οποία κανονικά διατηρείται άθικτη από το L2 κατά την εκκόλαψη (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν τη συμμετοχή της συσσώρευσης υγρών και της ωσμωτικής ρυθμιστικής ανεπάρκειας, καθώς και της αναστρέψιμης κυτταρικής βλάβης (RCI), στη διαδικασία σχηματισμού κενοτοπίων και διαπύησης (Εικ. 5).
Υποθέτοντας τον ρόλο του ιωδίου στον παρατηρούμενο σχηματισμό κενοτοπίων, διερευνήσαμε την νηματοκτόνο δράση του ιωδιούχου νατρίου (NaI) και του ιωδιούχου καλίου (KI). Ωστόσο, σε συγκεντρώσεις (0,1, 0,5 ή 1 mM), δεν επηρέασαν ούτε την επιβίωση ούτε τον σχηματισμό κενοτοπίων των νηματωδών (Συμπληρωματικό Σχήμα S5), αν και το 1 mM KI είχε μια ελαφρά νηματοκτόνο δράση. Από την άλλη πλευρά, η 7-ιωδοϊνδόλη (1 ή 2 mM), όπως και η 5-ιωδοϊνδόλη, προκάλεσε πολλαπλά κενοτόπια και δομικές παραμορφώσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Οι δύο ιωδοϊνδόλες εμφάνισαν παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά στους νηματώδεις πεύκου, ενώ το NaI και το KI όχι. Είναι ενδιαφέρον ότι η ινδόλη δεν προκάλεσε σχηματισμό κενοτοπίων στο B. xylophilus στις συγκεντρώσεις που εξετάστηκαν (δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Έτσι, τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το σύμπλοκο ινδόλης-ιωδίου είναι υπεύθυνο για την κενοτοπίωση και τον μεταβολισμό του B. xylophilus.
Μεταξύ των ινδολίων που εξετάστηκαν για νηματοκτονική δράση, η 5-ιωδοϊνδόλη είχε τον υψηλότερο δείκτη ολίσθησης -5,89 kcal/mol, ακολουθούμενη από την 7-ιωδοϊνδόλη (-4,48 kcal/mol), την 4-φθοροϊνδόλη (-4,33) και την ινδόλη (-4,03) (Σχήμα 6). Ο ισχυρός δεσμός υδρογόνου της 5-ιωδοϊνδόλης με τη λευκίνη 218 σταθεροποιεί τη σύνδεσή της, ενώ όλα τα άλλα παράγωγα ινδόλης συνδέονται με τη σερίνη 260 μέσω δεσμών υδρογόνου πλευρικής αλυσίδας. Μεταξύ άλλων μοντελοποιημένων ιωδοϊνδολίων, η 2-ιωδοϊνδόλη έχει τιμή σύνδεσης -5,248 kcal/mol, η οποία οφείλεται στον κύριο δεσμό υδρογόνου της με τη λευκίνη 218. Άλλες γνωστές συνδέσεις περιλαμβάνουν την 3-ιωδοϊνδόλη (-4,3 kcal/mol), την 4-ιωδοϊνδόλη (-4,0 kcal/mol) και την 6-φθοροϊνδόλη (-2,6 kcal/mol) (Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Οι περισσότερες αλογονωμένες ινδόλες και η ίδια η ινδόλη, με εξαίρεση την 5-ιωδοϊνδόλη και την 2-ιωδοϊνδόλη, σχηματίζουν δεσμό με τη σερίνη 260. Το γεγονός ότι ο δεσμός υδρογόνου με τη λευκίνη 218 υποδεικνύει αποτελεσματική σύνδεση υποδοχέα-συνδέτη, όπως παρατηρείται για την ιβερμεκτίνη (Συμπληρωματικό Σχήμα S7), επιβεβαιώνει ότι η 5-ιωδοϊνδόλη και η 2-ιωδοϊνδόλη, όπως και η ιβερμεκτίνη, συνδέονται στενά με την ενεργό θέση του υποδοχέα GluCL μέσω της λευκίνης 218 (Σχήμα 6 και Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Προτείνουμε ότι αυτή η σύνδεση απαιτείται για τη διατήρηση της δομής ανοιχτών πόρων του συμπλόκου GluCL και ότι με τη στενή σύνδεση με την ενεργό θέση του υποδοχέα GluCL, η 5-ιωδοϊνδόλη, η 2-ιωδοϊνδόλη, η αβερμεκτίνη και η ιβερμεκτίνη διατηρούν έτσι το κανάλι ιόντων ανοιχτό και επιτρέπουν την πρόσληψη υγρών.
Μοριακή σύνδεση ινδόλης και αλογονωμένης ινδόλης με GluCL. Προσανατολισμοί σύνδεσης των υποκαταστατών (Α) ινδόλης, (Β) 4-φθοροϊνδόλης, (Γ) 7-ιωδοϊνδόλης και (Δ) 5-ιωδοϊνδόλης στην ενεργό θέση της GluCL. Η πρωτεΐνη αναπαρίσταται με μια κορδέλα και οι δεσμοί υδρογόνου της κύριας αλυσίδας εμφανίζονται ως κίτρινες διακεκομμένες γραμμές. Τα (Α'), (Β'), (Γ') και (Δ') δείχνουν τις αλληλεπιδράσεις των αντίστοιχων υποκαταστατών με τα περιβάλλοντα υπολείμματα αμινοξέων και οι δεσμοί υδρογόνου πλευρικής αλυσίδας υποδεικνύονται με ροζ διακεκομμένα βέλη.
Διεξήχθησαν πειράματα για την αξιολόγηση της τοξικής επίδρασης της 5-ιωδοϊνδόλης στη βλάστηση των σπόρων λάχανου και ραπανιού. Η 5-ιωδοϊνδόλη (0,05 ή 0,1 mM) ή η αβερμεκτίνη (10 μg/mL) είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση στην αρχική βλάστηση και την εμφάνιση των φυταρίων (Σχήμα 7). Επιπλέον, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ του ρυθμού βλάστησης των μη επεξεργασμένων μαρτύρων και των σπόρων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη ή αβερμεκτίνη. Η επίδραση στην επιμήκυνση της κύριας ρίζας και στον αριθμό των πλευρικών ριζών που σχηματίστηκαν ήταν ασήμαντη, αν και 1 mM (10 φορές η ενεργός συγκέντρωσή της) 5-ιωδοϊνδόλης καθυστέρησε ελαφρώς την ανάπτυξη των πλευρικών ριζών. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η 5-ιωδοϊνδόλη είναι μη τοξική για τα φυτικά κύτταρα και δεν επηρεάζει τις διαδικασίες ανάπτυξης των φυτών στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν.
Επίδραση της 5-ιωδοϊνδόλης στη βλάστηση των σπόρων. Βλάστηση, βλάστηση και πλευρική ριζοβολία των σπόρων B. oleracea και R. raphanistrum σε μέσο άγαρ Murashige και Skoog με ή χωρίς αβερμεκτίνη ή 5-ιωδοϊνδόλη. Η βλάστηση καταγράφηκε μετά από 3 ημέρες επώασης στους 22°C.
Αυτή η μελέτη αναφέρει αρκετές περιπτώσεις θανάτωσης νηματωδών από ινδόλες. Είναι σημαντικό ότι αυτή είναι η πρώτη αναφορά μεθυλίωσης που προκαλείται από ιωδοϊνδόλη (μια διαδικασία που προκαλείται από τη συσσώρευση μικρών κενοτοπίων που σταδιακά συγχωνεύονται σε γιγάντια κενοτόπια, οδηγώντας τελικά σε ρήξη και θάνατο της μεμβράνης) σε πευκοβελόνες, με την ιωδοϊνδόλη να εμφανίζει σημαντικές νηματοκτόνους ιδιότητες παρόμοιες με εκείνες του εμπορικού νηματωδοκτόνου αβερμεκτίνης.
Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι οι ινδόλες ασκούν πολλαπλές σηματοδοτικές λειτουργίες σε προκαρυωτικά και ευκαρυωτικά, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής/σχηματισμού βιοφίλμ, της βακτηριακής επιβίωσης και της παθογένειας19,32,33,34. Πρόσφατα, οι πιθανές θεραπευτικές επιδράσεις των αλογονωμένων ινδολίων, των αλκαλοειδών ινδόλης και των ημισυνθετικών παραγώγων ινδόλης έχουν προσελκύσει εκτεταμένο ερευνητικό ενδιαφέρον35,36,37. Για παράδειγμα, οι αλογονωμένες ινδόλες έχουν αποδειχθεί ότι σκοτώνουν τα επίμονα κύτταρα Escherichia coli και Staphylococcus aureus37. Επιπλέον, είναι επιστημονικού ενδιαφέροντος να μελετηθεί η αποτελεσματικότητα των αλογονωμένων ινδολίων έναντι άλλων ειδών, γενών και βασιλείων, και αυτή η μελέτη αποτελεί ένα βήμα προς την επίτευξη αυτού του στόχου.
Εδώ, προτείνουμε έναν μηχανισμό για την θνησιμότητα που προκαλείται από την 5-ιωδοϊνδόλη στο C. elegans με βάση την αναστρέψιμη κυτταρική βλάβη (RCI) και τη μεθυλίωση (Σχήματα 4C και 5). Οι οιδηματώδεις αλλαγές όπως το πρήξιμο και η κενοτοπική εκφύλιση είναι δείκτες RCI και μεθυλίωσης, που εκδηλώνονται ως γιγάντια κενοτόπια στο κυτταρόπλασμα48,49. Η RCI παρεμβαίνει στην παραγωγή ενέργειας μειώνοντας την παραγωγή ATP, προκαλώντας βλάβη της αντλίας ATPάσης ή διαταράσσοντας τις κυτταρικές μεμβράνες και προκαλώντας ταχεία εισροή Na+, Ca2+ και νερού50,51,52. Τα ενδοκυτταροπλασματικά κενοτόπια εμφανίζονται σε ζωικά κύτταρα ως αποτέλεσμα της συσσώρευσης υγρού στο κυτταρόπλασμα λόγω της εισροής Ca2+ και νερού53. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο μηχανισμός κυτταρικής βλάβης είναι αναστρέψιμος εάν η βλάβη είναι προσωρινή και τα κύτταρα αρχίσουν να παράγουν ATP για ένα ορισμένο χρονικό διάστημα, αλλά εάν η βλάβη επιμένει ή επιδεινώνεται, τα κύτταρα πεθαίνουν.54 Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι τα νηματώδη που υποβάλλονται σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη δεν είναι σε θέση να αποκαταστήσουν την κανονική βιοσύνθεση μετά από έκθεση σε συνθήκες στρες.
Ο φαινότυπος μεθυλίωσης που προκαλείται από την 5-ιωδοϊνδόλη στο B. xylophilus μπορεί να οφείλεται στην παρουσία ιωδίου και στη μοριακή του κατανομή, καθώς η 7-ιωδοϊνδόλη είχε μικρότερη ανασταλτική επίδραση στο B. xylophilus από την 5-ιωδοϊνδόλη (Πίνακας 1 και Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν εν μέρει με τις μελέτες των Maltese et al. (2014), οι οποίοι ανέφεραν ότι η μετατόπιση της πυριδυλικής αζωτούχου ομάδας στην ινδόλη από την παρα- στη μετα- θέση κατάργησε την κενοτοπίωση, την αναστολή της ανάπτυξης και την κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα U251, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση του μορίου με μια συγκεκριμένη ενεργή θέση στην πρωτεΐνη είναι κρίσιμη27,44,45. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ινδόλης ή αλογονωμένων ινδολίων και υποδοχέων GluCL που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη υποστηρίζουν επίσης αυτή την άποψη, καθώς η 5- και η 2-ιωδοϊνδόλη βρέθηκαν να συνδέονται με τους υποδοχείς GluCL πιο ισχυρά από τις άλλες ινδόλες που εξετάστηκαν (Σχήμα 6 και Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Το ιώδιο στη δεύτερη ή πέμπτη θέση της ινδόλης βρέθηκε να συνδέεται με τη λευκίνη 218 του υποδοχέα GluCL μέσω δεσμών υδρογόνου της ραχοκοκαλιάς, ενώ άλλες αλογονωμένες ινδόλες και η ίδια η ινδόλη σχηματίζουν ασθενείς δεσμούς υδρογόνου πλευρικής αλυσίδας με τη σερίνη 260 (Σχήμα 6). Επομένως, εικάζουμε ότι ο εντοπισμός του αλογόνου παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση κενοτοπικής εκφύλισης, ενώ η στενή σύνδεση της 5-ιωδοϊνδόλης διατηρεί το ιοντικό κανάλι ανοιχτό, επιτρέποντας έτσι την ταχεία εισροή υγρών και τη ρήξη των κενοτοπίων. Ωστόσο, ο λεπτομερής μηχανισμός δράσης της 5-ιωδοϊνδόλης παραμένει προς προσδιορισμό.
Πριν από την πρακτική εφαρμογή της 5-ιωδοϊνδόλης, θα πρέπει να αναλυθεί η τοξική της επίδραση στα φυτά. Τα πειράματα βλάστησης των σπόρων μας έδειξαν ότι η 5-ιωδοϊνδόλη δεν είχε αρνητική επίδραση στη βλάστηση των σπόρων ή στις επακόλουθες διαδικασίες ανάπτυξης στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (Σχήμα 7). Έτσι, η παρούσα μελέτη παρέχει τη βάση για τη χρήση της 5-ιωδοϊνδόλης στο οικολογικό περιβάλλον για τον έλεγχο της βλαπτικότητας των νηματωδών των πεύκων για τα πεύκα.
Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η θεραπεία με βάση την ινδόλη αντιπροσωπεύει μια πιθανή προσέγγιση για την αντιμετώπιση του προβλήματος της αντοχής στα αντιβιοτικά και της εξέλιξης του καρκίνου55. Επιπλέον, οι ινδόλες διαθέτουν αντιβακτηριακές, αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιδιαβητικές, αντιικές, αντιπολλαπλασιαστικές και αντιφυματικές δράσεις και μπορούν να χρησιμεύσουν ως πολλά υποσχόμενη βάση για την ανάπτυξη φαρμάκων56,57. Αυτή η μελέτη προτείνει για πρώτη φορά την πιθανή χρήση του ιωδίου ως αντιπαρασιτικού και ανθελμινθικού παράγοντα.
Η αβερμεκτίνη ανακαλύφθηκε πριν από τρεις δεκαετίες και κέρδισε το βραβείο Νόμπελ το 2015, και η χρήση της ως ανθελμινθικού συνεχίζεται ενεργά. Ωστόσο, λόγω της ταχείας ανάπτυξης αντοχής στις αβερμεκτίνες σε νηματώδη και έντομα παράσιτα, απαιτείται μια εναλλακτική, χαμηλού κόστους και φιλική προς το περιβάλλον στρατηγική για τον έλεγχο της μόλυνσης από ΝΣΚ σε πεύκα. Αυτή η μελέτη αναφέρει επίσης τον μηχανισμό με τον οποίο η 5-ιωδοϊνδόλη σκοτώνει τους νηματώδεις των πεύκων και ότι η 5-ιωδοϊνδόλη έχει χαμηλή τοξικότητα στα φυτικά κύτταρα, γεγονός που ανοίγει καλές προοπτικές για τη μελλοντική εμπορική της εφαρμογή.
Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Yeungnam, Gyeongsan, Κορέα, και οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Yeungnam.
Τα πειράματα επώασης αυγών πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καθιερωμένες διαδικασίες43. Για την αξιολόγηση των ρυθμών εκκόλαψης (HR), ενήλικα νηματώδη ηλικίας 1 ημέρας (περίπου 100 θηλυκά και 100 αρσενικά) μεταφέρθηκαν σε τρυβλία Petri που περιείχαν τον μύκητα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Στη συνέχεια, τα αυγά απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-ιωδοϊνδόλη (0,05 mM και 0,1 mM) ή αβερμεκτίνη (10 μg/ml) ως εναιώρημα σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Αυτά τα εναιωρήματα (500 μl, περίπου 100 αυγά) μεταφέρθηκαν στα φρεάτια μιας πλάκας καλλιέργειας ιστών 24 φρεατίων και επωάστηκαν στους 22 °C. Οι μετρήσεις L2 έγιναν μετά από 24 ώρες επώασης, αλλά θεωρήθηκαν νεκρά εάν τα κύτταρα δεν κινούνταν όταν διεγείρονταν με ένα λεπτό σύρμα πλατίνας. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, το καθένα με έξι επαναλήψεις. Τα δεδομένα και από τα δύο πειράματα συνδυάστηκαν και παρουσιάστηκαν. Το ποσοστό του HR υπολογίζεται ως εξής:
Η θνησιμότητα των προνυμφών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προηγουμένως ανεπτυγμένες διαδικασίες. Συλλέχθηκαν αυγά νηματωδών και τα έμβρυα συγχρονίστηκαν με εκκόλαψη σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό για να δημιουργηθούν προνύμφες σταδίου L2. Οι συγχρονισμένες προνύμφες (περίπου 500 νηματώδη) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη (0,05 mM και 0,1 mM) ή αβερμεκτίνη (10 μg/ml) και εκτράφηκαν σε πλάκες Petri B. cinerea. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 22 °C, τα νηματώδη συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό και εξετάστηκαν για την παρουσία των σταδίων L2, L3 και L4. Η παρουσία των σταδίων L3 και L4 υποδήλωνε μετασχηματισμό των προνυμφών, ενώ η παρουσία του σταδίου L2 δεν υποδήλωνε μετασχηματισμό. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το Ψηφιακό Σύστημα Απεικόνισης Κυττάρων iRiS™. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, το καθένα με έξι επαναλήψεις. Τα δεδομένα και από τα δύο πειράματα συνδυάστηκαν και παρουσιάστηκαν.
Η τοξικότητα της 5-ιωδοϊνδόλης και της αβερμεκτίνης στους σπόρους αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμές βλάστησης σε πλάκες άγαρ Murashige και Skoog.62 Οι σπόροι B. oleracea και R. raphanistrum εμποτίστηκαν πρώτα σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό για μία ημέρα, πλύθηκαν με 1 ml αιθανόλης 100%, αποστειρώθηκαν με 1 ml 50% εμπορική χλωρίνη (3% υποχλωριώδες νάτριο) για 15 λεπτά και πλύθηκαν πέντε φορές με 1 ml αποστειρωμένο νερό. Οι αποστειρωμένοι σπόροι στη συνέχεια πιέστηκαν σε πλάκες άγαρ βλάστησης που περιείχαν 0,86 g/l (0,2X) μέσο Murashige και Skoog και 0,7% βακτηριολογικό άγαρ με ή χωρίς 5-ιωδοϊνδόλη ή αβερμεκτίνη. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 22 °C και οι εικόνες ελήφθησαν μετά από 3 ημέρες επώασης. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, καθένα από τα οποία είχε έξι επαναλήψεις.
Ώρα δημοσίευσης: 26 Φεβρουαρίου 2025