Ο νηματώδης πεύκου είναι ένα μεταναστευτικό ενδοπαράσιτο σε καραντίνα που είναι γνωστό ότι προκαλεί σοβαρές οικονομικές απώλειες στα οικοσυστήματα των πευκοδασών. Η παρούσα μελέτη εξετάζει τη νηματοκτόνο δράση των αλογονωμένων ινδολών έναντι των νηματωδών πεύκου και τον μηχανισμό δράσης τους. Οι νηματοκτόνες δράσεις της 5-ιωδοϊνδόλης και της αβερμεκτίνης (θετικός έλεγχος) έναντι των νηματωδών πεύκου ήταν παρόμοιες και υψηλές σε χαμηλές συγκεντρώσεις (10 μg/mL). Η 5-ιωδοϊνδόλη μείωσε τη γονιμότητα, την αναπαραγωγική δραστηριότητα, τη θνησιμότητα των εμβρύων και των προνυμφών και την κινητική συμπεριφορά. Οι μοριακές αλληλεπιδράσεις των προσδεμάτων με τους ειδικούς για ασπόνδυλα υποδοχείς διαύλων χλωρίου που καλύπτονται από γλουταμικό υποστηρίζουν την ιδέα ότι το 5-ιωδοϊνδόλιο, όπως η αβερμεκτίνη, συνδέεται στενά με την ενεργή θέση του υποδοχέα. Η 5-ιωδοινδόλη προκάλεσε επίσης διάφορες φαινοτυπικές παραμορφώσεις σε νηματώδεις, συμπεριλαμβανομένης της ανώμαλης κατάρρευσης/συρρίκνωσης οργάνων και της αυξημένης κενοτοπιοποίησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι τα κενοτόπια μπορεί να παίζουν ρόλο στον θάνατο που προκαλείται από μεθυλίωση νηματωδών. Είναι σημαντικό ότι η 5-ιωδοϊνδόλη ήταν μη τοξική και για τα δύο είδη φυτών (λάχανο και ραπανάκι). Έτσι, αυτή η μελέτη καταδεικνύει ότι η εφαρμογή ιωδοινδόλης υπό περιβαλλοντικές συνθήκες μπορεί να ελέγξει τον τραυματισμό του μαρασμού του πεύκου.
Ο νηματώδης του ξύλου πεύκου (Bursaphelenchus xylophilus) ανήκει στους νηματώδεις από ξύλο πεύκου (PWN), μεταναστευτικά ενδοπαρασιτικά νηματώδη που είναι γνωστό ότι προκαλούν σοβαρή οικολογική βλάβη στα οικοσυστήματα των πευκοδασών1. Η νόσος του μαρασμού του πεύκου (PWD) που προκαλείται από τον νηματώδη ξύλο του πεύκου γίνεται σοβαρό πρόβλημα σε πολλές ηπείρους, συμπεριλαμβανομένης της Ασίας και της Ευρώπης, και στη Βόρεια Αμερική, ο νηματώδης καταστρέφει τα εισαγόμενα είδη πεύκου1,2. Η πτώση των πεύκων αποτελεί μείζον οικονομικό πρόβλημα και η προοπτική παγκόσμιας εξάπλωσής του είναι ανησυχητική3. Τα ακόλουθα είδη πεύκου προσβάλλονται συχνότερα από το νηματώδη: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii και Pinus radiata4. Ο νηματώδης πεύκου είναι μια σοβαρή ασθένεια που μπορεί να σκοτώσει τα πεύκα μέσα σε εβδομάδες ή μήνες μετά τη μόλυνση. Επιπλέον, οι εστίες νηματωδών πεύκου είναι συχνές σε μια ποικιλία οικοσυστημάτων, επομένως έχουν καθιερωθεί επίμονες αλυσίδες μόλυνσης1.
Το Bursaphelenchus xylophilus είναι φυτοπαρασιτικό νηματώδη σε καραντίνα που ανήκει στην υπεροικογένεια Aphelenchoidea και στην κατηγορία 102.5. Ο νηματώδης τρέφεται με μύκητες και αναπαράγεται στους ιστούς του ξύλου των πεύκων, εξελισσόμενος σε τέσσερα διαφορετικά προνυμφικά στάδια: L1, L2, L3, L4 και ένα ενήλικο άτομο1,6. Υπό συνθήκες έλλειψης τροφής, ο νηματώδης πεύκου περνά σε ένα εξειδικευμένο προνυμφικό στάδιο – dauer, το οποίο παρασιτοποιεί τον φορέα του – το σκαθάρι του φλοιού του πεύκου (Monochamus alternatus) και μεταφέρεται σε υγιή πεύκα. Σε υγιείς ξενιστές, τα νηματώδη μεταναστεύουν γρήγορα μέσω των φυτικών ιστών και τρέφονται με παρεγχυματώδη κύτταρα, γεγονός που οδηγεί σε διάφορες αντιδράσεις υπερευαισθησίας, μαρασμό πεύκου και θάνατο εντός ενός έτους μετά τη μόλυνση1,7,8.
Ο βιολογικός έλεγχος των νηματωδών του πεύκου είναι από καιρό μια πρόκληση, με τα μέτρα καραντίνας να χρονολογούνται από τον 20ο αιώνα. Οι τρέχουσες στρατηγικές για τον έλεγχο των νηματωδών του πεύκου περιλαμβάνουν κυρίως χημικές επεξεργασίες, συμπεριλαμβανομένου του υποκαπνισμού του ξύλου και της εμφύτευσης νηματοκτόνων σε κορμούς δέντρων. Τα πιο συχνά χρησιμοποιούμενα νηματοκτόνα είναι η αβερμεκτίνη και η βενζοϊκή αβερμεκτίνη, που ανήκουν στην οικογένεια των αβερμεκτινών. Αυτές οι ακριβές χημικές ουσίες είναι ιδιαίτερα αποτελεσματικές έναντι πολλών ειδών νηματωδών και θεωρούνται περιβαλλοντικά ασφαλείς9. Ωστόσο, η επαναλαμβανόμενη χρήση αυτών των νηματοκτόνων αναμένεται να δημιουργήσει πίεση επιλογής που σχεδόν σίγουρα θα οδηγήσει στην εμφάνιση ανθεκτικών νηματωδών πεύκου, όπως έχει αποδειχθεί για αρκετά έντομα, όπως τα Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella και τα νηματώδη Trichostrongylus colubriformis και Ostertagia που σταδιακά ανέπτυξαν αντοχή σε, αβερμεκτίνες10,11,12. Επομένως, τα πρότυπα αντοχής πρέπει να μελετώνται τακτικά και να ελέγχονται συνεχώς τα νηματοκτόνα για να βρεθούν εναλλακτικά, οικονομικά αποδοτικά και φιλικά προς το περιβάλλον μέτρα για τον έλεγχο της PVD. Τις τελευταίες δεκαετίες, αρκετοί συγγραφείς έχουν προτείνει τη χρήση φυτικών εκχυλισμάτων, αιθέριων ελαίων και πτητικών ως παραγόντων ελέγχου νηματωδών13,14,15,16.
Πρόσφατα δείξαμε τη νηματοκτόνο δράση της ινδόλης, ενός μεσοκυττάριου και διαβασιλικού μορίου σηματοδότησης, στο Caenorhabditis elegans 17 . Η ινδόλη είναι ένα ευρέως διαδεδομένο ενδοκυτταρικό σήμα στη μικροβιακή οικολογία, που ελέγχει πολυάριθμες λειτουργίες που επηρεάζουν τη μικροβιακή φυσιολογία, το σχηματισμό σπορίων, τη σταθερότητα του πλασμιδίου, την αντίσταση στα φάρμακα, το σχηματισμό βιοφίλμ και τη λοιμογόνο δράση 18, 19 . Η δράση της ινδόλης και των παραγώγων της έναντι άλλων παθογόνων νηματωδών δεν έχει μελετηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε τη νηματοκτόνο δράση 34 ινδολών έναντι νηματωδών πεύκου και διευκρινίσαμε τον μηχανισμό δράσης της πιο ισχυρής 5-ιωδοϊνδόλης χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο, φωτογραφία με χρονική καθυστέρηση και πειράματα μοριακής δέσμευσης, και αξιολογήσαμε τις τοξικές της επιδράσεις στα φυτά χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία βλάστησης σπόρων.
Υψηλές συγκεντρώσεις (>1,0 mM) ινδόλης έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι έχουν νηματοκτόνο δράση στα νηματώδη17. Μετά από θεραπεία του Β. xylophilus (μεικτά στάδια ζωής) με ινδόλη ή 33 διαφορετικά παράγωγα ινδόλης στο 1 mM, η θνησιμότητα του Β. xylophilus μετρήθηκε με μέτρηση ζωντανών και νεκρών νηματωδών στις ομάδες ελέγχου και στις ομάδες που έλαβαν θεραπεία. Πέντε ινδόλες εμφάνισαν σημαντική νηματοκτόνο δράση. η επιβίωση της ομάδας ελέγχου που δεν υποβλήθηκε σε θεραπεία ήταν 95 ± 7% μετά από 24 ώρες. Από τις 34 ινδόλες που δοκιμάστηκαν, η 5-ιωδοϊνδόλη και η 4-φθοροϊνδόλη στο 1 mM προκάλεσαν 100% θνησιμότητα, ενώ η 5,6-διφθοροϊνδόλη, η 7-καρβοξυλική μεθυλινδόλη και η 7-ιωδοϊνδόλη προκάλεσαν περίπου 50% θνησιμότητα (Πίνακας 1).
Επίδραση της 5-ιωδοϊνδόλης στον σχηματισμό κενοτοπίων και τον μεταβολισμό του νηματώδους ξύλου πεύκου. (Α) Επίδραση αβερμεκτίνης και 5-ιωδοϊνδόλης σε ενήλικα αρσενικά νηματώδη, (Β) αυγά νηματωδών σταδίου L1 και (C) μεταβολισμός του B. xylophilus, (i) κενοτόπια δεν παρατηρήθηκαν σε 0 h, η θεραπεία οδήγησε σε (ii) κενοτόπια, (iii) συσσώρευση κενοτοπίων, κενοτόπιο (πολλαπλό) κενοτόπιο. σύντηξη κενοτοπίων και (vi) σχηματισμός γιγάντιων κενοτοπίων. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν διόγκωση κενοτοπίων, τα μπλε βέλη υποδεικνύουν σύντηξη κενοτοπίων και τα μαύρα βέλη δείχνουν γιγάντια κενοτόπια. Μπάρα κλίμακας = 50 μm.
Επιπλέον, αυτή η μελέτη περιέγραψε επίσης τη διαδοχική διαδικασία του θανάτου που προκαλείται από μεθάνιο σε νηματώδεις πεύκου (Εικόνα 4C). Ο μεθανογόνος θάνατος είναι ένας μη αποπτωτικός τύπος κυτταρικού θανάτου που σχετίζεται με τη συσσώρευση προεξέχων κυτταροπλασματικών κενοτοπίων27. Τα μορφολογικά ελαττώματα που παρατηρούνται στους νηματώδεις του πεύκου φαίνεται να σχετίζονται στενά με τον μηχανισμό του θανάτου που προκαλείται από το μεθάνιο. Η μικροσκοπική εξέταση σε διαφορετικούς χρόνους έδειξε ότι σχηματίστηκαν γιγάντια κενοτόπια μετά από 20 ώρες έκθεσης σε 5-ιωδοϊνδόλιο (0,1 mM). Παρατηρήθηκαν μικροσκοπικά κενοτόπια μετά από 8 ώρες θεραπείας και ο αριθμός τους αυξήθηκε μετά από 12 ώρες. Αρκετά μεγάλα κενοτόπια παρατηρήθηκαν μετά από 14 ώρες. Αρκετά συντηγμένα κενοτόπια ήταν καθαρά ορατά μετά από 12-16 ώρες θεραπείας, υποδεικνύοντας ότι η σύντηξη κενοτοπίων είναι η βάση του μηχανισμού του μεθανογόνου θανάτου. Μετά από 20 ώρες, πολλά γιγάντια κενοτόπια βρέθηκαν σε όλο το σκουλήκι. Αυτές οι παρατηρήσεις αντιπροσωπεύουν την πρώτη αναφορά μετουσιώσεως στο C. elegans.
Σε σκουλήκια που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλιο, παρατηρήθηκε επίσης συσσωμάτωση και ρήξη κενοτοπίων (Εικ. 5), όπως αποδεικνύεται από την κάμψη των σκουληκιών και την απελευθέρωση κενοτοπίων στο περιβάλλον. Παρατηρήθηκε επίσης διάσπαση κενοτοπίων στη μεμβράνη του κελύφους του αυγού, η οποία διατηρείται κανονικά ανέπαφη από το L2 κατά την εκκόλαψη (Συμπληρωματικό Σχήμα S2). Αυτές οι παρατηρήσεις υποστηρίζουν τη συμμετοχή της συσσώρευσης υγρού και της ωσμορρυθμιστικής αποτυχίας, καθώς και της αναστρέψιμης κυτταρικής βλάβης (RCI), στη διαδικασία σχηματισμού κενοτοπίων και διαπότισης (Εικ. 5).
Υποθέτοντας τον ρόλο του ιωδίου στον παρατηρούμενο σχηματισμό κενοτοπίων, διερευνήσαμε τη νηματοκτόνο δράση του ιωδιούχου νατρίου (NaI) και του ιωδιούχου καλίου (KI). Ωστόσο, σε συγκεντρώσεις (0,1, 0,5 ή 1 mM), δεν επηρέασαν ούτε την επιβίωση των νηματωδών ούτε τον σχηματισμό κενοτοπίων (Συμπληρωματικό Σχήμα S5), αν και το 1 mM ΚΙ είχε μια ελαφρά νηματοκτόνο δράση. Από την άλλη πλευρά, το 7-ιωδοϊνδόλιο (1 ή 2 mM), όπως το 5-ιωδοϊνδόλιο, προκάλεσε πολλαπλά κενοτόπια και δομικές παραμορφώσεις (Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Τα δύο ιωδοινδόλια έδειξαν παρόμοια φαινοτυπικά χαρακτηριστικά στους νηματώδεις πεύκου, ενώ τα NaI και KI όχι. Είναι ενδιαφέρον ότι η ινδόλη δεν προκάλεσε σχηματισμό κενοτοπίων στο Β. xylophilus στις συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Έτσι, τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν ότι το σύμπλοκο ινδόλης-ιωδίου είναι υπεύθυνο για τη δημιουργία κενοτοπίων και το μεταβολισμό του B. xylophilus.
Μεταξύ των ινδολών που δοκιμάστηκαν για νηματοκτόνο δράση, η 5-ιωδοϊνδόλη είχε τον υψηλότερο δείκτη ολίσθησης -5,89 kcal/mol, ακολουθούμενη από 7-ιωδοϊνδόλη (-4,48 kcal/mol), 4-φθοροϊνδόλη (-4,33) και ινδόλη (-4,03) (Εικόνα 6). Ο ισχυρός δεσμός υδρογόνου κορμού του 5-ιωδοϊνδόλης με τη λευκίνη 218 σταθεροποιεί τη σύνδεσή του, ενώ όλα τα άλλα παράγωγα ινδόλης συνδέονται με τη σερίνη 260 μέσω δεσμών υδρογόνου πλευρικής αλυσίδας. Μεταξύ άλλων μοντελοποιημένων ιωδοινδόλων, το 2-ιωδοϊνδόλιο έχει τιμή δέσμευσης -5,248 kcal/mol, η οποία οφείλεται στον κύριο δεσμό υδρογόνου του με τη λευκίνη 218. Άλλες γνωστές δεσμεύσεις περιλαμβάνουν 3-ιωδοϊνδόλιο (-4,3 kcal/mol), 4-ιωδοϊνδόλιο (-4,0 kcal/mol), και 6,0 kcal/mol (-4,0 kcal/mol) kcal/mol) (Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Οι περισσότερες αλογονωμένες ινδόλες και η ίδια η ινδόλη, με εξαίρεση το 5-ιωδοϊνδόλιο και το 2-ιωδοϊνδόλιο, σχηματίζουν δεσμό με τη σερίνη 260. Το γεγονός ότι ο δεσμός υδρογόνου με τη λευκίνη 218 είναι ενδεικτικό της αποτελεσματικής δέσμευσης υποδοχέα-συνδέτη, όπως παρατηρείται για την ιβερμεκτίνη (Συμπληρωματικό Σχήμα 5 και ιωδοϊνδολη). Το 2-ιωδοϊνδόλιο, όπως και η ιβερμεκτίνη, συνδέεται στενά με την ενεργό θέση του υποδοχέα GluCL μέσω λευκίνης 218 (Εικ. 6 και Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Προτείνουμε ότι αυτή η δέσμευση απαιτείται για τη διατήρηση της δομής ανοιχτών πόρων του συμπλέγματος GluCL και ότι δεσμεύοντας στενά την ενεργή θέση του υποδοχέα GluCL, 5-ιωδοϊνδόλη, 2-ιωδοϊνδόλη, αβερμεκτίνη και ιβερμεκτίνη διατηρείται έτσι το κανάλι ιόντων ανοιχτό και επιτρέπει την πρόσληψη υγρού.
Μοριακή σύνδεση ινδόλης και αλογονωμένης ινδόλης στο GluCL. Προσανατολισμοί δέσμευσης (Α) ινδόλης, (Β) 4-φθοροϊνδόλης, (C) 7-ιωδοϊνδόλης, και (D) συνδέτες 5-ιωδοϊνδόλης στην ενεργό θέση του GluCL. Η πρωτεΐνη αντιπροσωπεύεται από μια κορδέλα και οι δεσμοί υδρογόνου της ραχοκοκαλιάς εμφανίζονται ως κίτρινες διακεκομμένες γραμμές. Τα (Α'), (Β'), (C') και (D') δείχνουν τις αλληλεπιδράσεις των αντίστοιχων προσδεμάτων με τα περιβάλλοντα υπολείμματα αμινοξέων και οι δεσμοί υδρογόνου της πλευρικής αλυσίδας υποδεικνύονται με ροζ διακεκομμένα βέλη.
Διεξήχθησαν πειράματα για την αξιολόγηση της τοξικής επίδρασης της 5-ιωδοϊνδόλης στη βλάστηση των σπόρων του λάχανου και του ραπανιού. Το 5-ιωδοϊνδόλιο (0,05 ή 0,1 mM) ή η αβερμεκτίνη (10 μg/mL) είχαν μικρή ή καθόλου επίδραση στην αρχική βλάστηση και την εμφάνιση των φυτών (Εικόνα 7). Επιπλέον, δεν βρέθηκε σημαντική διαφορά μεταξύ του ρυθμού βλάστησης των μη επεξεργασμένων μαρτύρων και των σπόρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-ιωδοϊνδόλη ή αβερμεκτίνη. Η επίδραση στην επιμήκυνση της ρίζας και στον αριθμό των πλευρικών ριζών που σχηματίστηκαν ήταν ασήμαντη, αν και 1 mM (10 φορές η ενεργή συγκέντρωση του) 5-ιωδοϊνδόλης καθυστέρησε ελαφρώς την ανάπτυξη των πλευρικών ριζών. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η 5-ιωδοϊνδόλη είναι μη τοξική για τα φυτικά κύτταρα και δεν παρεμβαίνει στις διαδικασίες ανάπτυξης των φυτών στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν.
Επίδραση της 5-ιωδοϊνδόλης στη βλάστηση των σπόρων. Βλάστηση, βλάστηση και πλευρική ριζοβολία των σπόρων B. oleracea και R. raphanistrum σε υλικό Murashige και Skoog agar με ή χωρίς αβερμεκτίνη ή 5-ιωδοϊνδόλη. Η βλάστηση καταγράφηκε μετά από 3 ημέρες επώασης στους 22°C.
Αυτή η μελέτη αναφέρει αρκετές περιπτώσεις θανάτωσης νηματωδών από ινδόλες. Είναι σημαντικό ότι αυτή είναι η πρώτη αναφορά μεθυλίωσης που προκαλεί το ιωδοινδόλιο (μια διαδικασία που προκαλείται από τη συσσώρευση μικρών κενοτοπίων που συγχωνεύονται σταδιακά σε γιγάντια κενοτόπια, οδηγώντας τελικά σε ρήξη και θάνατο της μεμβράνης) σε πευκοβελόνες, με το ιωδοινδόλη να παρουσιάζει σημαντικές νηματοκτόνες ιδιότητες παρόμοιες με αυτές του εμπορικού νηματοκτόνου averm.
Οι ινδόλες έχουν αναφερθεί προηγουμένως ότι ασκούν πολλαπλές λειτουργίες σηματοδότησης σε προκαρυώτες και ευκαρυώτες, συμπεριλαμβανομένης της αναστολής/σχηματισμού βιοφίλμ, της βακτηριακής επιβίωσης και της παθογένειας19,32,33,34. Πρόσφατα, τα πιθανά θεραπευτικά αποτελέσματα των αλογονωμένων ινδολών, των αλκαλοειδών ινδόλης και των ημισυνθετικών παραγώγων ινδόλης έχουν προσελκύσει εκτεταμένο ερευνητικό ενδιαφέρον35,36,37. Για παράδειγμα, οι αλογονωμένες ινδόλες έχει αποδειχθεί ότι σκοτώνουν επίμονα κύτταρα Escherichia coli και Staphylococcus aureus37. Επιπλέον, είναι επιστημονικού ενδιαφέροντος η μελέτη της αποτελεσματικότητας των αλογονωμένων ινδολών έναντι άλλων ειδών, γενών και βασιλείων, και αυτή η μελέτη είναι ένα βήμα προς την επίτευξη αυτού του στόχου.
Εδώ, προτείνουμε έναν μηχανισμό για τη θνησιμότητα που προκαλείται από 5-ιωδοϊνδόλη στο C. elegans με βάση την αναστρέψιμη κυτταρική βλάβη (RCI) και τη μεθυλίωση (Εικόνες 4C και 5). Οι οιδηματικές αλλαγές όπως το πρήξιμο και ο εκφυλισμός των κενοτοπίων είναι δείκτες RCI και μεθυλίωσης, που εκδηλώνονται ως γιγάντια κενοτόπια στο κυτταρόπλασμα48,49. Το RCI παρεμβαίνει στην παραγωγή ενέργειας μειώνοντας την παραγωγή ATP, προκαλώντας αστοχία της αντλίας ATPase ή διαταράσσει τις κυτταρικές μεμβράνες και προκαλώντας ταχεία εισροή Na+, Ca2+ και νερού50,51,52. Τα ενδοκυτταροπλασματικά κενοτόπια προκύπτουν στα ζωικά κύτταρα ως αποτέλεσμα της συσσώρευσης υγρού στο κυτταρόπλασμα λόγω της εισροής Ca2+ και νερού53. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτός ο μηχανισμός κυτταρικής βλάβης είναι αναστρέψιμος εάν η βλάβη είναι προσωρινή και τα κύτταρα αρχίσουν να παράγουν ATP για ορισμένο χρονικό διάστημα, αλλά εάν η βλάβη επιμένει ή επιδεινωθεί, τα κύτταρα πεθαίνουν.54 Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι τα νηματώδη που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη δεν μπορούν να αποκαταστήσουν τη φυσιολογική βιοσύνθεση μετά από έκθεση σε συνθήκες στρες.
Ο φαινότυπος μεθυλίωσης που προκαλείται από το 5-ιωδοϊνδόλιο στο B. xylophilus μπορεί να οφείλεται στην παρουσία ιωδίου και στη μοριακή του κατανομή, καθώς το 7-ιωδοϊνδόλιο είχε μικρότερη ανασταλτική επίδραση στο B. xylophilus από το 5-ιωδοϊνδόλιο (Πίνακας 1 και Συμπληρωματικό Σχήμα S6). Αυτά τα αποτελέσματα είναι εν μέρει συνεπή με τις μελέτες των Maltese et al. (2014), ο οποίος ανέφερε ότι η μετατόπιση της μερίδας πυριδυλικού αζώτου στην ινδόλη από την παρα- στη μετα-θέση κατάργησε την κενοτοπίωση, την αναστολή ανάπτυξης και την κυτταροτοξικότητα στα κύτταρα U251, υποδηλώνοντας ότι η αλληλεπίδραση του μορίου με μια συγκεκριμένη ενεργή θέση στην πρωτεΐνη είναι κρίσιμη25,44,44. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ ινδόλης ή αλογονωμένων ινδολών και υποδοχέων GluCL που παρατηρήθηκαν σε αυτή τη μελέτη υποστηρίζουν επίσης αυτήν την ιδέα, καθώς το 5- και το 2-ιωδοϊνδόλιο βρέθηκε να συνδέεται με τους υποδοχείς GluCL πιο ισχυρά από τις άλλες ινδόλες που εξετάστηκαν (Εικόνα 6 και Συμπληρωματικό Σχήμα S8). Το ιώδιο στη δεύτερη ή την πέμπτη θέση της ινδόλης βρέθηκε να συνδέεται με τη λευκίνη 218 του υποδοχέα GluCL μέσω δεσμών υδρογόνου κορμού, ενώ άλλες αλογονωμένες ινδόλες και η ίδια η ινδόλη σχηματίζουν ασθενείς δεσμούς υδρογόνου πλευρικής αλυσίδας με τη σερίνη 260 (Εικόνα 6). Ως εκ τούτου, εικάζουμε ότι ο εντοπισμός του αλογόνου παίζει σημαντικό ρόλο στην επαγωγή του εκφυλισμού των κενοτοπίων, ενώ η στενή δέσμευση του 5-ιωδοϊνδόλης διατηρεί το κανάλι ιόντων ανοιχτό, επιτρέποντας έτσι την ταχεία εισροή υγρού και τη ρήξη κενοτοπίων. Ωστόσο, ο λεπτομερής μηχανισμός δράσης της 5-ιωδοϊνδόλης μένει να προσδιοριστεί.
Πριν από την πρακτική εφαρμογή της 5-ιωδοϊνδόλης, θα πρέπει να αναλυθεί η τοξική της επίδραση στα φυτά. Τα πειράματα βλάστησης σπόρων μας έδειξαν ότι το 5-ιωδοϊνδόλη δεν είχε αρνητική επίδραση στη βλάστηση των σπόρων ή στις επακόλουθες διαδικασίες ανάπτυξης στις συγκεντρώσεις που μελετήθηκαν (Εικόνα 7). Έτσι, αυτή η μελέτη παρέχει τη βάση για τη χρήση της 5-ιωδοϊνδόλης στο οικολογικό περιβάλλον για τον έλεγχο της βλαβερότητας των νηματωδών πεύκου στα πεύκα.
Προηγούμενες αναφορές έχουν δείξει ότι η θεραπεία με βάση την ινδόλη αντιπροσωπεύει μια πιθανή προσέγγιση για την αντιμετώπιση του προβλήματος της αντοχής στα αντιβιοτικά και της εξέλιξης του καρκίνου55. Επιπλέον, οι ινδόλες διαθέτουν αντιβακτηριακές, αντικαρκινικές, αντιοξειδωτικές, αντιφλεγμονώδεις, αντιδιαβητικές, αντιικές, αντιπολλαπλασιαστικές και αντιφυματικές δράσεις και μπορεί να χρησιμεύσουν ως πολλά υποσχόμενη βάση για την ανάπτυξη φαρμάκων56,57. Αυτή η μελέτη προτείνει για πρώτη φορά την πιθανή χρήση του ιωδίου ως αντιπαρασιτικού και ανθελμινθικού παράγοντα.
Η αβερμεκτίνη ανακαλύφθηκε πριν από τρεις δεκαετίες και κέρδισε το βραβείο Νόμπελ το 2015 και η χρήση της ως ανθελμινθικό συνεχίζεται ακόμη ενεργά. Ωστόσο, λόγω της ταχείας ανάπτυξης αντοχής στις αβερμεκτίνες στα νηματώδη και τα έντομα παράσιτα, απαιτείται μια εναλλακτική, χαμηλού κόστους και φιλική προς το περιβάλλον στρατηγική για τον έλεγχο της μόλυνσης από PWN στα πεύκα. Αυτή η μελέτη αναφέρει επίσης τον μηχανισμό με τον οποίο το 5-ιωδοϊνδόλιο σκοτώνει τους νηματώδεις του πεύκου και ότι το 5-ιωδοϊνδόλιο έχει χαμηλή τοξικότητα στα φυτικά κύτταρα, γεγονός που ανοίγει καλές προοπτικές για τη μελλοντική του εμπορική εφαρμογή.
Όλα τα πειράματα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Yeungnam, Gyeongsan, Κορέα, και οι μέθοδοι πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες της Επιτροπής Δεοντολογίας του Πανεπιστημίου Yeungnam.
Πειράματα επώασης αυγών πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας καθιερωμένες διαδικασίες43. Για να εκτιμηθούν τα ποσοστά εκκόλαψης (HR), ενήλικα νηματώδη ηλικίας 1 ημέρας (περίπου 100 θηλυκά και 100 αρσενικά) μεταφέρθηκαν σε τρυβλία Petri που περιείχαν τον μύκητα και αφέθηκαν να αναπτυχθούν για 24 ώρες. Τα αυγά στη συνέχεια απομονώθηκαν και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5-ιωδοϊνδόλη (0,05 mM και 0,1 mM) ή αβερμεκτίνη (10 μg/ml) ως εναιώρημα σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό. Αυτά τα εναιωρήματα (500 μl, περίπου 100 αυγά) μεταφέρθηκαν στα φρεάτια μιας πλάκας ιστοκαλλιέργειας 24 φρεατίων και επωάστηκαν στους 22 °C. Οι μετρήσεις L2 έγιναν μετά από 24 ώρες επώασης, αλλά θεωρήθηκαν νεκρά εάν τα κύτταρα δεν κινούνταν όταν διεγείρονταν με ένα λεπτό σύρμα πλατίνας. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, το καθένα με έξι επαναλήψεις. Τα δεδομένα και από τα δύο πειράματα συνδυάστηκαν και παρουσιάστηκαν. Το ποσοστό του HR υπολογίζεται ως εξής:
Η θνησιμότητα των προνυμφών αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας προηγούμενες διαδικασίες. Τα αυγά των νηματωδών συλλέχθηκαν και τα έμβρυα συγχρονίστηκαν με εκκόλαψη σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό για να δημιουργηθούν προνύμφες σταδίου L2. Οι συγχρονισμένες προνύμφες (περίπου 500 νηματώδεις) υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5-ιωδοϊνδόλη (0,05 mM και 0,1 mM) ή αβερμεκτίνη (10 μg/ml) και εκτράφηκαν σε τρυβλία B. cinerea Petri. Μετά από 48 ώρες επώασης στους 22 °C, τα νηματώδη συλλέχθηκαν σε στείρο απεσταγμένο νερό και εξετάστηκαν για την παρουσία των σταδίων L2, L3 και L4. Η παρουσία των σταδίων L3 και L4 έδειξε μετασχηματισμό προνυμφών, ενώ η παρουσία του σταδίου L2 δεν έδειξε μετασχηματισμό. Οι εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ψηφιακής απεικόνισης κυττάρων iRiS™. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, το καθένα με έξι επαναλήψεις. Τα δεδομένα και από τα δύο πειράματα συνδυάστηκαν και παρουσιάστηκαν.
Η τοξικότητα της 5-ιωδοϊνδόλης και της αβερμεκτίνης στους σπόρους αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας δοκιμές βλάστησης σε τρυβλία άγαρ Murashige και Skoog.62 σπόροι B. oleracea και R. raphanistrum πρώτα εμποτίστηκαν σε αποστειρωμένο απεσταγμένο νερό για μία ημέρα, πλύθηκαν με 1 ml 100% 100% στεριωμένη αιθανόλη στο εμπόριο υποχλωριώδες νάτριο) για 15 λεπτά και πλύθηκε πέντε φορές με 1 ml αποστειρωμένο νερό. Οι αποστειρωμένοι σπόροι στη συνέχεια πιέστηκαν σε πλάκες άγαρ βλάστησης που περιείχαν 0,86 g/l (0,2Χ) μέσο Murashige και Skoog και 0,7% βακτηριολογικό άγαρ με ή χωρίς 5-ιωδοϊνδόλη ή αβερμεκτίνη. Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 22 °C και οι εικόνες λήφθηκαν μετά από 3 ημέρες επώασης. Αυτό το πείραμα διεξήχθη σε δύο στάδια, καθένα από τα οποία είχε έξι επαναλήψεις.
Ώρα δημοσίευσης: Φεβ-26-2025