Σας ευχαριστούμε που επισκεφθήκατε το Nature.com. Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS. Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε μια νεότερη έκδοση του προγράμματος περιήγησής σας (ή να απενεργοποιήσετε τη Λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer). Εν τω μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ ή JavaScript.
Η ανακάλυψη και η ευεργετική χρήση φυσικών προϊόντων μπορεί να βοηθήσει στη βελτίωση της ανθρώπινης ζωής. Οι χημικές ουσίες που αναστέλλουν την ανάπτυξη των φυτών χρησιμοποιούνται ευρέως ως ζιζανιοκτόνα για τον έλεγχο των ζιζανίων. Λόγω της ανάγκης χρήσης διαφορετικών τύπων ζιζανιοκτόνων, υπάρχει η ανάγκη να εντοπιστούν ενώσεις με νέους μηχανισμούς δράσης. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση Ν-αλκοξυπυρρολίου, την κουμαμοναμίδη, από το Streptomyces werraensis MK493-CF1 και καθιερώσαμε την πλήρη διαδικασία σύνθεσης. Μέσω δοκιμασιών βιολογικής δραστικότητας, ανακαλύψαμε ότι το ουρ-μονοαμικό οξύ είναι ένα συνθετικό ενδιάμεσο του ουρ-μονοαμιδίου και ένα πιθανό...αναστολέας ανάπτυξης φυτώνΕπιπλέον, έχουμε αναπτύξει διάφορα παράγωγα ουρβενονικού οξέος, συμπεριλαμβανομένου του παραγώγου ουρβενυλοξυ (UDA), το οποίο έχει υψηλή ζιζανιοκτόνο δράση χωρίς να επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa. Διαπιστώσαμε επίσης ότι τα παράγωγα ουρμοτονικού οξέος διαταράσσουν τους μικροσωληνίσκους των φυτών. Επιπλέον, το KAND επηρεάζει τα νημάτια ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Αυτές οι πολύπλευρες επιδράσεις διαφέρουν από εκείνες των γνωστών αναστολέων μικροσωληνίσκων και υποδηλώνουν έναν νέο μηχανισμό δράσης για το ουρσονικό οξύ, ο οποίος αποτελεί σημαντικό πλεονέκτημα στην ανάπτυξη νέων ζιζανιοκτόνων.
Η ανακάλυψη και η πρακτική εφαρμογή ωφέλιμων φυσικών προϊόντων και των παραγώγων τους αποτελεί μέσο βελτίωσης της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται από μικροοργανισμούς, φυτά και έντομα έχουν οδηγήσει σε σημαντικές προόδους στην ιατρική και τη γεωργία. Πολλά αντιβιοτικά και αντιλευχαιμικά φάρμακα έχουν αναπτυχθεί από φυσικά προϊόντα. Επιπλέον, διάφοροι τύποιφυτοφάρμακα, μυκητοκτόνα και ζιζανιοκτόνα εξάγονται από αυτά τα φυσικά προϊόντα για χρήση στη γεωργία. Συγκεκριμένα, τα ζιζανιοκτόνα ελέγχου ζιζανίων είναι σημαντικά εργαλεία για την αύξηση των αποδόσεων των καλλιεργειών στη σύγχρονη γεωργία και διάφοροι τύποι ενώσεων χρησιμοποιούνται ήδη εμπορικά. Αρκετές κυτταρικές διεργασίες στα φυτά, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός των αμινοξέων, η σύνθεση κυτταρικού τοιχώματος, η ρύθμιση της μίτωσης, η σηματοδότηση φυτοορμονών ή η σύνθεση πρωτεϊνών, θεωρούνται τυπικοί στόχοι των ζιζανιοκτόνων. Οι ενώσεις που αναστέλλουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων είναι μια κοινή κατηγορία ζιζανιοκτόνων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των φυτών επηρεάζοντας τη μιτωτική ρύθμιση2.
Οι μικροσωληνίσκοι είναι συστατικά του κυτταροσκελετού και είναι ευρέως συντηρημένοι στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Το ετεροδιμερές της τουμπουλίνης αποτελείται από α-τουμπουλίνη και β-τουμπουλίνη που σχηματίζουν γραμμικά πρωτονημάτια μικροσωληνίσκων, με 13 πρωτονημάτια να σχηματίζουν μια κυλινδρική δομή. Οι μικροσωληνίσκοι παίζουν πολλαπλούς ρόλους στα φυτικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του καθορισμού του σχήματος των κυττάρων, της κυτταρικής διαίρεσης και της ενδοκυτταρικής μεταφοράς3,4. Τα φυτικά κύτταρα περιέχουν μικροσωληνίσκους κάτω από την μεσοφασική πλασματική μεμβράνη και αυτοί οι λεγόμενοι φλοιώδεις μικροσωληνίσκοι πιστεύεται ότι ελέγχουν την οργάνωση των μικροϊνιδίων κυτταρίνης μέσω της ρύθμισης των συμπλεγμάτων συνθάσης κυτταρίνης4,5. Οι φλοιώδεις μικροσωληνίσκοι των επιδερμικών κυττάρων της ρίζας, που υπάρχουν στη ζώνη ταχείας επιμήκυνσης της άκρης της ρίζας, βρίσκονται πλευρικά και οι μικροΐνες κυτταρίνης ακολουθούν αυτούς τους μικροσωληνίσκους και περιορίζουν την κατεύθυνση της κυτταρικής επέκτασης, προωθώντας έτσι την ανισότροπη επιμήκυνση των κυττάρων. Επομένως, η λειτουργία των μικροσωληνίσκων σχετίζεται στενά με τη μορφολογία των φυτών. Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων σε γονίδια που κωδικοποιούν την τουμπουλίνη προκαλούν ασύμμετρη διαμόρφωση των φλοιωδών συστοιχιών μικροσωληνίσκων και ανάπτυξη στην αριστερή ή δεξιά πλευρά του Arabidopsis 6,7. Ομοίως, μεταλλάξεις σε πρωτεΐνες που σχετίζονται με τους μικροσωληνίσκους και ρυθμίζουν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε παραμορφωμένη ανάπτυξη των ριζών8,9,10,11,12,13. Επιπλέον, η επεξεργασία με ζιζανιοκτόνα που διαταράσσουν τους μικροσωληνίσκους, όπως η δισοπυραμίδη, επίσης γνωστή ως πρετιλαχλόρ, προκαλεί επίσης πλάγια ανάπτυξη ριζών στην αριστερή πλευρά14. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ακριβής ρύθμιση της λειτουργίας των μικροσωληνίσκων είναι κρίσιμη για τον προσδιορισμό της κατεύθυνσης της ανάπτυξης των φυτών.
Έχουν ανακαλυφθεί διάφοροι τύποι αναστολέων μικροσωληνίσκων και αυτά τα φάρμακα έχουν συμβάλει σημαντικά στην κυτταροσκελετική έρευνα, καθώς και στη γεωργία και την ιατρική2. Συγκεκριμένα, η ορυζαλίνη, οι ενώσεις δινιτροανιλίνης, η δισοπυραμίδη, οι ενώσεις που σχετίζονται με το βενζαμίδιο και τα ανάλογά τους μπορούν να αναστείλουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων και, ως εκ τούτου, να αναστείλουν την ανάπτυξη των φυτών. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται ευρέως ως ζιζανιοκτόνα. Ωστόσο, επειδή οι μικροσωληνίσκοι αποτελούν σημαντικό συστατικό των φυτικών και ζωικών κυττάρων, οι περισσότεροι αναστολείς μικροσωληνίσκων είναι κυτταροτοξικοί και για τους δύο τύπους κυττάρων. Επομένως, παρά την αναγνωρισμένη χρησιμότητά τους ως ζιζανιοκτόνα, ένας περιορισμένος αριθμός αντιμικροσωληνίσκων χρησιμοποιείται για πρακτικούς σκοπούς.
Το Streptomyces είναι ένα γένος της οικογένειας Streptomyces, το οποίο περιλαμβάνει αερόβια, Gram-θετικά, νηματοειδή βακτήρια και είναι ευρέως γνωστό για την ικανότητά του να παράγει ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών μεταβολιτών. Ως εκ τούτου, θεωρείται μία από τις σημαντικότερες πηγές νέων βιολογικά ενεργών φυσικών προϊόντων. Στην παρούσα μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση που ονομάζεται κουμαμοναμίδη, η οποία απομονώθηκε από το Streptomyces werraensis MK493-CF1 και το S. werraensis ISP 5486. Χρησιμοποιώντας φασματική ανάλυση και πλήρη φασματική ανάλυση, χαρακτηρίστηκε η δομή του κουμαμοναμιδίου και προσδιορίστηκε ο μοναδικός σκελετός Ν-αλκοξυπυρρολίου του. Το ουρσμονικό οξύ, ένα συνθετικό ενδιάμεσο του ουρσμοναμιδίου και των παραγώγων του, βρέθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη και τη βλάστηση του δημοφιλούς φυτού μοντέλου Arabidopsis thaliana. Σε μια μελέτη σχέσης δομής-δραστικότητας, διαπιστώσαμε ότι μια ένωση με C9 τροποποιημένη σε ουρσονικό οξύ, που ονομάζεται εννεϋλοξυ παράγωγο του ουρσονικού οξέος (KAND), ενισχύει σημαντικά την ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη και τη βλάστηση. Αξίζει να σημειωθεί ότι ο πρόσφατα ανακαλυφθείς αναστολέας ανάπτυξης φυτών επηρέασε επίσης την ανάπτυξη του καπνού και του ηπατικού βότανου και δεν ήταν κυτταροτοξικός για τα βακτήρια ή τα κύτταρα HeLa. Επιπλέον, ορισμένα παράγωγα ουρμοτονικού οξέος προκαλούν παραμορφωμένο φαινότυπο ρίζας, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτά τα παράγωγα επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τους μικροσωληνίσκους. Σύμφωνα με αυτή την ιδέα, οι παρατηρήσεις μας σε μικροσωληνίσκους που έχουν επισημανθεί είτε ανοσοϊστοχημικά είτε με φθορίζουσες πρωτεΐνες δείχνουν ότι η επεξεργασία με KAND αποπολυμερίζει τους μικροσωληνίσκους. Επιπλέον, η επεξεργασία με παράγωγα κουμαμοτονικού οξέος διέσπασε τα μικρονημάτια ακτίνης. Έτσι, ανακαλύψαμε έναν νέο αναστολέα ανάπτυξης φυτών, του οποίου ο μοναδικός μηχανισμός δράσης περιλαμβάνει την καταστροφή του κυτταροσκελετού.
Το στέλεχος MK493-CF1 απομονώθηκε από έδαφος στο Shinagawa-ku του Τόκιο. Το στέλεχος MK493-CF1 σχημάτισε καλά διακλαδισμένο στρωματικό μυκήλιο. Προσδιορίστηκε η μερική αλληλουχία του γονιδίου 16S ριβοσωμικού RNA (1422 bp). Αυτό το στέλεχος είναι πολύ παρόμοιο με το S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: τυπικό στέλεχος, 99,93%). Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, προσδιορίστηκε ότι αυτό το στέλεχος ήταν στενά συγγενικό με το στέλεχος τύπου S. werraensis. Επομένως, ονομάσαμε προσωρινά αυτό το στέλεχος S. werraensis MK493-CF1. Το S. werraensis ISP 5486T παράγει επίσης τις ίδιες βιοδραστικές ενώσεις. Δεδομένου ότι υπήρξε μικρή πρώιμη έρευνα για την απόκτηση φυσικών προϊόντων από αυτόν τον μικροοργανισμό, διεξήχθη περαιτέρω χημική έρευνα. Μετά την καλλιέργεια του S. werraensis MK493-CF1 σε μέσο κριθής με ζύμωση στερεάς κατάστασης στους 30°C για 14 ημέρες, το μέσο εκχυλίστηκε με 50% EtOH. 60 ml δείγματος ξηράνθηκαν για να ληφθούν 59,5 mg ακατέργαστου εκχυλίσματος. Το ακατέργαστο εκχύλισμα υποβλήθηκε σε HPLC αντίστροφης φάσης για να δώσει Ν-μεθοξυ-1Η-πυρρολο-2-καρβοξαμίδιο (1, που ονομάζεται κουμαμοναμίδιο, 36,0 mg). Η συνολική ποσότητα του 1 είναι περίπου 60% του ακατέργαστου εκχυλίσματος. Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να μελετήσουμε λεπτομερώς τις ιδιότητες του κουμαμοτοαμιδίου 1.
Η κουμαμοναμίδη 1 είναι μια λευκή άμορφη σκόνη και η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HRESIMS) επιβεβαιώνει το C6H8N2O2 (Εικ. 1). Το θραύσμα πυρρόλης υποκατεστημένου με C2 αυτής της ένωσης χαρακτηρίζεται από δH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Hz, H-4), δH 6,78 (1H, d, J = 2,5, δH στο φάσμα 1H NMR: 4,5 Hz, H-5) και δH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), και το φάσμα 13C NMR δείχνει την παρουσία τεσσάρων ατόμων άνθρακα sp2. Η παρουσία μιας αμιδικής ομάδας στη θέση C2 αξιολογήθηκε με συσχέτιση HMBC από το πρωτόνιο C-3 προς τον άνθρακα αμιδικού καρβονυλίου στο δC 161,1. Επιπλέον, οι κορυφές 1H και 13C NMR σε δH 4,10 (3H, S) και δC 68,3 υποδεικνύουν την παρουσία Ν-μεθοξυομάδων στο μόριο. Αν και η σωστή θέση της μεθοξυομάδας δεν είχε ακόμη προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας φασματοσκοπική ανάλυση όπως η ενισχυμένη φασματοσκοπία διαφοράς και η πυρηνική συντομογραφία Overhauser (NOEDF), το Ν-μεθοξυ-1H-πυρρολ-2-καρβοξαμίδιο έγινε η πρώτη υποψήφια ένωση.
Για να προσδιοριστεί η σωστή δομή του 1, πραγματοποιήθηκε ολική σύνθεση (Εικ. 2α). Η επεξεργασία της εμπορικά διαθέσιμης 2-αμινοπυριδίνης 2 με m-CPBA είχε ως αποτέλεσμα το αντίστοιχο Ν-οξείδιο 3 σε ποσοτική απόδοση. Μετά την 2-αμινοαζιδίωση του 2, η αντίδραση κυκλοσυμπύκνωσης που περιγράφεται από τον Abramovich πραγματοποιήθηκε σε βενζόλιο στους 90°C για να ληφθεί το επιθυμητό 1-υδροξυ-1Η-πυρρολο-2-καρβονιτρίλιο 5 σε γραμμάρια. Ταχύτητα 60% (δύο στάδια). 15,16. Η μεθυλίωση και η υδρόλυση του 4 έδωσαν στη συνέχεια 1-μεθοξυ-1Η-πυρρολο-2-καρβοξυλικό οξύ (που ονομάζεται «κουμοτονικό οξύ», 6) σε καλή απόδοση (70%, δύο στάδια). Τέλος, η αμιδίωση μέσω ενδιάμεσου χλωριδίου οξέος 6 χρησιμοποιώντας υδατική αμμωνία έδωσε το αμίδιο Kumamoto 1 σε απόδοση 98%. Όλα τα φασματικά δεδομένα του συντεθειμένου 1 ήταν παρόμοια με το απομονωμένο 1, επομένως προσδιορίστηκε η δομή του 1.
Γενική σύνθεση και ανάλυση της βιολογικής δράσης της ουρβεναμίδης και του ουρβενικού οξέος. (α) Ολική σύνθεση αμιδίου Kumamoto. (β) Σπορόφυτα Arabidopsis Columbia (Col) άγριου τύπου επτά ημερών αναπτύχθηκαν σε τρυβλία Murashige και Skoog (MS) που περιείχαν κουμαμοναμίδη 6 ή κουμαμοναμίδη 1 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Γραμμή κλίμακας = 1 cm.
Αρχικά, αξιολογήσαμε τις βιολογικές δράσεις της ουρβεναμίδης και των ενδιαμέσων της ως προς την ικανότητά τους να ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών. Προσθέσαμε διάφορες συγκεντρώσεις ουρσμοναμίδης 1 ή ουρσμονικού οξέος 6 σε μέσο άγαρ MS και καλλιεργήσαμε σπορόφυτα Arabidopsis thaliana σε αυτό το μέσο. Αυτές οι δοκιμασίες έδειξαν ότι υψηλές συγκεντρώσεις (500 μM) της 6 ανέστειλαν την ανάπτυξη των ριζών (Εικ. 2b). Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε διάφορα παράγωγα αντικαθιστώντας τη θέση N1 της 6 και πραγματοποιήσαμε μελέτες σχέσης δομής-δραστικότητας σε αυτά (η διαδικασία σύνθεσης αναλόγων περιγράφεται στις Συμπληρωματικές Πληροφορίες (SI)). Τα σπορόφυτα Arabidopsis αναπτύχθηκαν σε ένα μέσο που περιείχε 50 μM παράγωγα ουρσονικού οξέος και μετρήθηκε το μήκος της ρίζας, όπως φαίνεται στην εικόνα. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 3a, b και S1, τα κουμαμοοξέα έχουν διαφορετικά μήκη γραμμικών αλκοξυ αλυσίδων (9, 10, 11, 12 και 13) ή μεγάλες αλκοξυ αλυσίδες (15, 16 και 17) στη θέση N1. Τα παράγωγα έδειξαν σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των ριζών. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η εφαρμογή 200 μM 10, 11 ή 17 ανέστειλε τη βλάστηση (Εικ. 3c και S2).
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας του αμιδίου Kumamoto και σχετικών ενώσεων. (α) Δομή και σχήμα σύνθεσης αναλόγων. (β) Ποσοτικοποίηση του μήκους ρίζας σπορόφυτων 7 ημερών που καλλιεργούνται σε μέσο MS με ή χωρίς παράγωγα κουμαμοναμιδίου 50 μM. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (δοκιμή t, p< 0,05). n>18. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Το nt σημαίνει «δεν δοκιμάστηκε» επειδή περισσότερο από το 50% των σπόρων δεν βλάστησε. (γ) Ποσοτικοποίηση του ρυθμού βλάστησης των επεξεργασμένων σπόρων που επωάστηκαν για 7 ημέρες σε μέσο MS με ή χωρίς 200 μM κουμαμοναμίδη και σχετικές ενώσεις. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (δοκιμή χ2). n=96.
Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη αλκυλικών πλευρικών αλυσίδων μακρύτερων από C9 μείωσε την ανασταλτική δράση, υποδηλώνοντας ότι οι ενώσεις που σχετίζονται με το κουμαμοτικό οξύ απαιτούν πλευρικές αλυσίδες ορισμένου μεγέθους για να επιδείξουν τη βιολογική τους δράση.
Επειδή η ανάλυση της σχέσης δομής-δραστικότητας έδειξε ότι το C9 τροποποιήθηκε σε ουρσονικό οξύ και το εννεϋλοξυ παράγωγο του ουρσονικού οξέος (εφεξής αναφερόμενο ως KAND 11) ήταν ο πιο αποτελεσματικός αναστολέας ανάπτυξης των φυτών, διεξήγαμε έναν πιο λεπτομερή χαρακτηρισμό του KAND 11. Η επεξεργασία του Arabidopsis με 50 μM KAND 11 εμπόδισε σχεδόν πλήρως τη βλάστηση, ενώ χαμηλότερες συγκεντρώσεις (40, 30, 20 ή 10 μM) του KAND 11 ανέστειλαν την ανάπτυξη των ριζών με δοσοεξαρτώμενο τρόπο (Εικ. 4α, β). Για να ελέγξουμε εάν το KAND 11 επηρεάζει τη βιωσιμότητα του μεριστώματος της ρίζας, εξετάσαμε μεριστώματα ρίζας χρωματισμένα με ιωδιούχο προπίδιο (PI) και μετρήσαμε το μέγεθος της επιφάνειας του μεριστώματος. Το μέγεθος του μεριστώματος των σπορόφυτων που αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 25 μM KAND-11 ήταν 151,1 ± 32,5 μm, ενώ το μέγεθος του μεριστώματος των σπορόφυτων που αναπτύχθηκαν σε μέσο ελέγχου που περιείχε DMSO ήταν 264,7 ± 30,8 μm (Εικ. 4c, d), γεγονός που υποδεικνύει ότι το KAND-11 αποκαθιστά την κυτταρική δραστηριότητα. Μερίστωμα ρίζας. Σύμφωνα με αυτό, η επεξεργασία με KAND 11 μείωσε την ποσότητα του σήματος δείκτη κυτταρικής διαίρεσης CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS στο μερίστωμα ρίζας (Εικ. 4e) 17. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το KAND 11 αναστέλλει την ανάπτυξη των ριζών μειώνοντας τη δραστηριότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων.
Ανάλυση της ανασταλτικής επίδρασης των παραγώγων ουρβενονικού οξέος (παράγωγα ουρβενυλοξυ) στην ανάπτυξη. (α) Σπορόφυτα Col άγριου τύπου 7 ημερών που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND 11. Γραμμή κλίμακας = 1 cm. (β) Ποσοτικοποίηση του μήκους της ρίζας. Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (δοκιμή Tukey HSD, p< 0,05). n>16. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). (γ) Ομοεστιακή μικροσκοπία ριζών Col άγριου τύπου χρωματισμένων με ιωδιούχο προπίδιο που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με ή χωρίς 25 μM KAND 11. Οι λευκές αγκύλες υποδεικνύουν το μερίστωμα ρίζας. Γραμμή κλίμακας = 100 µm. (δ) Ποσοτικοποίηση του μεγέθους του μεριστώματος ρίζας (n = 10 έως 11). Οι στατιστικές διαφορές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας t-test (p< 0,05). Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο μέγεθος μεριστώματος. (ε) Μικροσκοπία διαφορικής αντίθεσης παρεμβολής (DIC) ενός μεριστώματος ρίζας που περιέχει το κατασκεύασμα CDKB2. 1pro: CDKB2. 1-GUS χρωματισμένο και χρωματισμένο σε σπορόφυτα 5 ημερών που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με ή χωρίς δοκιμασία KAND 25 µM.
Η φυτοτοξικότητα του KAND 11 ελέγχθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ένα άλλο δικοτυλήδονο φυτό, τον καπνό (Nicotiana tabacum), και έναν σημαντικό οργανισμό-μοντέλο χερσαίων φυτών, το ηπατικό βότανο (Marchantia polymorpha). Όπως και στην περίπτωση του Arabidopsis, τα σπορόφυτα καπνού SR-1 που αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 25 μM KAND 11 παρήγαγαν βραχύτερες ρίζες (Εικ. 5α). Επιπλέον, 40 από τους 48 σπόρους βλάστησαν σε τρυβλία που περιείχαν 200 μM KAND 11, ενώ και οι 48 σπόροι βλάστησαν σε εικονικά επεξεργασμένο μέσο, υποδεικνύοντας ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις KAND ήταν σημαντικές (p< 0,05; chi test -square) ανέστειλε τη βλάστηση του καπνού. (Εικ. 5b). Επιπλέον, η συγκέντρωση του KAND 11 που ανέστειλε την βακτηριακή ανάπτυξη στο ηπατικό βότανο ήταν παρόμοια με την αποτελεσματική συγκέντρωση στο Arabidopsis (Εικ. 5c). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το KAND 11 μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη μιας ποικιλίας φυτών. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανή κυτταροτοξικότητα των ενώσεων που σχετίζονται με το μονοαμίδιο της αρκούδας σε άλλους οργανισμούς, δηλαδή τα ανθρώπινα κύτταρα HeLa και το στέλεχος Escherichia coli DH5α, ως αντιπροσώπους ανώτερων ζωικών και βακτηριακών κυττάρων, αντίστοιχα. Σε μια σειρά δοκιμασιών πολλαπλασιασμού κυττάρων, παρατηρήσαμε ότι η κουμαμοναμίδη 1, το κουμαμοναμιδικό οξύ 6 και το KAND 11 δεν επηρέασαν την ανάπτυξη κυττάρων HeLa ή E. coli σε συγκεντρώσεις 100 μM (Εικ. 5d,e).
Αναστολή ανάπτυξης του KAND 11 σε οργανισμούς που δεν ανήκουν στην οικογένεια Arabidopsis. (α) Σπορόφυτα καπνού SR-1 άγριου τύπου δύο εβδομάδων αναπτύχθηκαν σε κατακόρυφα τοποθετημένες πλάκες MS που περιείχαν 25 μM KAND 11. (β) Σπορόφυτα καπνού SR-1 άγριου τύπου δύο εβδομάδων αναπτύχθηκαν σε οριζόντια τοποθετημένες πλάκες MS που περιείχαν 200 μM KAND 11. (γ) Μπουμπούκια ηπατίτιδας Tak-1 άγριου τύπου δύο εβδομάδων που αναπτύχθηκαν σε πλάκες Gamborg B5 με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND 11. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν σπόρια που σταμάτησαν να αναπτύσσονται εντός της περιόδου επώασης των δύο εβδομάδων. (δ) Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων κυττάρων HeLa. Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε σε σταθερά χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων 8 (Dojindo). Ως έλεγχος, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε αγωγή με 5 μg/ml ακτινομυκίνη D (Act D), η οποία αναστέλλει την μεταγραφή της RNA πολυμεράσης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. (ε) Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων E. coli. Η ανάπτυξη του E. coli αναλύθηκε μετρώντας την OD600. Ως έλεγχος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 50 μg/ml αμπικιλλίνη (Amp), η οποία αναστέλλει τη σύνθεση του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.
Για να αποκρυπτογραφήσουμε τον μηχανισμό δράσης της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από ενώσεις που σχετίζονται με την ουραμίδη, αναλύσαμε εκ νέου παράγωγα ουρβενικού οξέος με μέτρια ανασταλτικά αποτελέσματα, όπως φαίνεται στην εικόνα. Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2b, 6a, τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν σε πλάκες άγαρ που περιείχαν υψηλές συγκεντρώσεις (200 μM) ουρμοτονικού οξέος 6 παρήγαγαν βραχύτερες και αριστερώς καμπυλωμένες ρίζες (θ = – 23,7 ± 6,1), ενώ από τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν στο μέσο ελέγχου, τα σπορόφυτα παρήγαγαν σχεδόν ευθείες ρίζες (θ = – 3,8 ± 7,1). Αυτή η χαρακτηριστική λοξή ανάπτυξη είναι γνωστό ότι προκύπτει από δυσλειτουργία των φλοιωδών μικροσωληνίσκων14,18. Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, τα φάρμακα αποσταθεροποίησης των μικροσωληνίσκων, δισοπυραμίδη και ορυζαλίνη, προκάλεσαν παρόμοια κλίση ρίζας υπό τις συνθήκες ανάπτυξής μας (Σχήματα 2b, 6a). Ταυτόχρονα, δοκιμάσαμε παράγωγα ουρμοτονικού οξέος και επιλέξαμε αρκετά από αυτά που, σε ορισμένες συγκεντρώσεις, προκάλεσαν λοξή ανάπτυξη ριζών. Οι ενώσεις 8, 9 και 15 άλλαξαν την κατεύθυνση ανάπτυξης των ριζών στα 75 μM, 50 μM και 40 μM, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι ενώσεις μπορούν να αποσταθεροποιήσουν αποτελεσματικά τους μικροσωληνίσκους (Εικ. 2b, 6a). Δοκιμάσαμε επίσης το πιο ισχυρό παράγωγο ουρσολικού οξέος, το KAND 11, σε χαμηλότερη συγκέντρωση (15 μM) και διαπιστώσαμε ότι η εφαρμογή του KAND 11 ανέστειλε την ανάπτυξη των ριζών και ότι η κατεύθυνση ανάπτυξης των ριζών ήταν ανομοιογενής, αν και έτεινε να έχει κλίση προς τα αριστερά (Σχήμα C3). Επειδή υψηλότερες συγκεντρώσεις φαρμάκων που αποσταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους μερικές φορές αναστέλλουν την ανάπτυξη των φυτών αντί να προκαλούν κλίση των ριζών, στη συνέχεια αξιολογήσαμε την πιθανότητα το KAND 11 να επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους παρατηρώντας τους φλοιώδεις μικροσωληνίσκους στα επιδερμικά κύτταρα των ριζών. Η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα κατά της β-τουμπουλίνης σε επιδερμικά κύτταρα ριζών δενδρυλλίων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 25 μM KAND 11 έδειξε την εξαφάνιση σχεδόν όλων των φλοιωδών μικροσωληνίσκων στα επιδερμικά κύτταρα στη ζώνη επιμήκυνσης (Εικ. 6b). Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το κουμματοτονικό οξύ και τα παράγωγά του δρουν άμεσα ή έμμεσα στους μικροσωληνίσκους διαταράσσοντάς τους και ότι αυτές οι ενώσεις είναι νέοι αναστολείς των μικροσωληνίσκων.
Το ουρσονικό οξύ και τα παράγωγά του μεταβάλλουν τους φλοιώδεις μικροσωληνίσκους στο Arabidopsis thaliana. (α) Γωνία κλίσης ρίζας που μετρήθηκε παρουσία διαφόρων παραγώγων ουρμοτονικού οξέος στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Αναλύθηκαν επίσης οι επιδράσεις δύο ενώσεων που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν τους μικροσωληνίσκους: η δισοπυραμίδη και η ορυζαλίνη. Το ένθετο δείχνει το πρότυπο που χρησιμοποιήθηκε για τη μέτρηση της γωνίας ανάπτυξης της ρίζας. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (δοκιμή t, p< 0,05). n>19. Γραμμή κλίμακας = 1 cm. (β) Φλοιώδεις μικροσωληνίσκοι σε επιδερμικά κύτταρα στη ζώνη επιμήκυνσης. Μικροσωληνίσκοι σε ρίζες άγριου τύπου Arabidopsis Col που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με ή χωρίς 25 μM KAND 11 απεικονίστηκαν με ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα β-τουμπουλίνης και δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με Alexa Fluor. Γραμμή κλίμακας = 10 µm. (γ) Μιτωτική δομή μικροσωληνίσκων στο μερίστωμα της ρίζας. Οι μικροσωληνίσκοι απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση. Οι μιτωτικές δομές, συμπεριλαμβανομένων των ζωνών πρόφασης, των ατράκτων και των φραγμοπλαστών, μετρήθηκαν από ομοεστιακές εικόνες. Τα βέλη υποδεικνύουν μιτωτικές δομές μικροσωληνίσκων. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (t test, p< 0,05). n>9. Γραμμή κλίμακας = 50 µm.
Παρόλο που η Ursa έχει την ικανότητα να διαταράσσει τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων, ο μηχανισμός δράσης της αναμένεται να είναι διαφορετικός από τους τυπικούς παράγοντες αποπολυμερισμού των μικροσωληνίσκων. Για παράδειγμα, υψηλότερες συγκεντρώσεις παραγόντων αποπολυμερισμού των μικροσωληνίσκων, όπως η δισοπυραμίδη και η ορυζαλίνη, προκαλούν ανισότροπη επέκταση των επιδερμικών κυττάρων, ενώ η KAND 11 όχι. Επιπλέον, η ταυτόχρονη εφαρμογή της KAND 11 και της δισοπυραμίδης οδήγησε σε μια συνδυασμένη απόκριση ανάπτυξης ριζών που προκαλείται από δισοπυραμίδη και παρατηρήθηκε αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από την KAND 11 (Εικ. S4). Αναλύσαμε επίσης την απόκριση του υπερευαίσθητου μεταλλάγματος δισοπυραμίδης 1-1 (phs1-1) στην KAND 11. Η phs1-1 έχει μια μη κανονική σημειακή μετάλλαξη κινάσης τουμπουλίνης και παράγει βραχύτερες ρίζες όταν υποβάλλεται σε αγωγή με δισοπυραμίδη9,20. Τα σπορόφυτα μεταλλαγμένου phs1-1 που αναπτύχθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε KAND 11 είχαν βραχύτερες ρίζες παρόμοιες με αυτές που αναπτύχθηκαν σε δισοπυραμίδη (εικ. S5).
Επιπλέον, παρατηρήσαμε μιτωτικές δομές μικροσωληνίσκων, όπως ζώνες προφάσης, άτρακτους και φραγμοπλάστες, στο ριζικό μερίστωμα των σπορόφυτων που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11. Σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις για το CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στον αριθμό των μιτωτικών μικροσωληνίσκων (Εικ. .6c).
Για να χαρακτηρίσουμε την κυτταροτοξικότητα του KAND 11 σε υποκυτταρική ανάλυση, υποβάλαμε σε επεξεργασία κύτταρα εναιωρήματος BY-2 καπνού με KAND 11 και παρατηρήσαμε την απόκρισή τους. Αρχικά προσθέσαμε KAND 11 σε κύτταρα BY-2 που εκφράζουν TagRFP-TUA6, το οποίο φθορίζουσα σήμανση μικροσωληνίσκων, για να αξιολογήσουμε την επίδραση του KAND 11 στους φλοιώδεις μικροσωληνίσκους. Η πυκνότητα των φλοιωδών μικροσωληνίσκων αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας, η οποία ποσοτικοποίησε το ποσοστό των κυτταροσκελετικών εικονοστοιχείων μεταξύ των κυτταροπλασματικών εικονοστοιχείων. Τα αποτελέσματα της δοκιμασίας έδειξαν ότι μετά από επεξεργασία με 50 μM ή 100 μM KAND 11 για 1 ώρα, η πυκνότητα μειώθηκε σημαντικά σε 0,94 ± 0,74% ή 0,23 ± 0,28%, αντίστοιχα, ενώ η πυκνότητα των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ανήλθε σε 1,61 ± 0,34% (Εικ. 7α). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την παρατήρηση στο Arabidopsis ότι η επεξεργασία με KAND 11 προκαλεί αποπολυμερισμό των φλοιωδών μικροσωληνίσκων (Εικ. 6β). Εξετάσαμε επίσης τη σειρά BY-2 με νημάτια ακτίνης επισημασμένα με GFP-ABD μετά από επεξεργασία με την ίδια συγκέντρωση KAND 11 και παρατηρήσαμε ότι η επεξεργασία με KAND 11 διέσπασε τα νημάτια ακτίνης. Η επεξεργασία με 50 μM ή 100 μM KAND 11 για 1 ώρα μείωσε σημαντικά την πυκνότητα των νηματίων ακτίνης σε 1,20 ± 0,62% ή 0,61 ± 0,26%, αντίστοιχα, ενώ η πυκνότητα στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ήταν 1,69 ± 0,51% (Εικ. 2). 7b). Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με τις επιδράσεις της προπυζαμίδης, η οποία δεν επηρεάζει τα νημάτια ακτίνης, και της λατρουνγκουλίνης Β, ενός αποπολυμεριστή ακτίνης που δεν επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους (Σχήμα SI S6). Επιπλέον, η επεξεργασία με κουμαμοναμίδη 1, κουμαμοναμιδικό οξύ 6 ή KAND 11 δεν επηρέασε τους μικροσωληνίσκους στα κύτταρα HeLa (Σχήμα SI S7). Έτσι, ο μηχανισμός δράσης του KAND 11 πιστεύεται ότι είναι διαφορετικός από αυτόν των γνωστών διαταραχών του κυτταροσκελετού. Επιπλέον, η μικροσκοπική παρατήρηση των κυττάρων BY-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11 αποκάλυψε την έναρξη του κυτταρικού θανάτου κατά τη διάρκεια της αγωγής με KAND 11 και έδειξε ότι το ποσοστό των νεκρών κυττάρων που είχαν χρωματιστεί με μπλε Evans δεν αυξήθηκε σημαντικά μετά από 30 λεπτά αγωγής με KAND 11, ενώ μετά από 90 λεπτά αγωγής με 50 μM ή 100 μM KAND, ο αριθμός των νεκρών κυττάρων αυξήθηκε σε 43,7% ή 80,1%, αντίστοιχα (Εικ. 7c). Συνολικά, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το νέο παράγωγο ουρσολικού οξέος KAND 11 είναι ένας φυτο-ειδικός αναστολέας του κυτταροσκελετού με έναν προηγουμένως άγνωστο μηχανισμό δράσης.
Το KAND επηρεάζει τους φλοιώδεις μικροσωληνίσκους, τα νημάτια ακτίνης και τη βιωσιμότητα των κυττάρων BY-2 του καπνού. (α) Οπτικοποίηση των φλοιωδών μικροσωληνίσκων σε κύτταρα BY-2 παρουσία TagRFP-TUA6. Τα κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11 (50 μM ή 100 μM) ή DMSO εξετάστηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία. Η πυκνότητα των φλοιωδών μικροσωληνίσκων υπολογίστηκε από μικρογραφίες 25 ανεξάρτητων κυττάρων. Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (δοκιμή Tukey HSD, σελ.< 0,05). Γραμμή κλίμακας = 10 µm. (β) Νήματα φλοιώδους ακτίνης σε κύτταρα BY-2 που απεικονίστηκαν παρουσία GFP-ABD2. Τα κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11 (50 μM ή 100 μM) ή DMSO εξετάστηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία. Η πυκνότητα των νημάτων φλοιώδους ακτίνης υπολογίστηκε από μικρογραφίες 25 ανεξάρτητων κυττάρων. Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (δοκιμή Tukey HSD, p< 0,05). Γραμμή κλίμακας = 10 µm. (γ) Παρατήρηση νεκρών κυττάρων BY-2 με χρώση Evans blue. Τα κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11 (50 μM ή 100 μM) ή DMSO εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτεινού πεδίου. n=3. Γραμμή κλίμακας = 100 µm.
Η ανακάλυψη και η εφαρμογή νέων φυσικών προϊόντων έχει οδηγήσει σε σημαντικές προόδους σε διάφορες πτυχές της ανθρώπινης ζωής, συμπεριλαμβανομένης της ιατρικής και της γεωργίας. Έχει διεξαχθεί ιστορική έρευνα για την απόκτηση χρήσιμων ενώσεων από φυσικούς πόρους. Συγκεκριμένα, οι ακτινομύκητες είναι γνωστό ότι είναι χρήσιμοι ως αντιπαρασιτικά αντιβιοτικά για νηματώδη λόγω της ικανότητάς τους να παράγουν διάφορους δευτερογενείς μεταβολίτες όπως η αβερμεκτίνη, η κύρια ένωση της ιβερμεκτίνης και της βλεομυκίνης και τα παράγωγά της, που χρησιμοποιούνται ιατρικά ως αντικαρκινικός παράγοντας21,22. Ομοίως, μια ποικιλία ζιζανιοκτόνων ενώσεων έχει ανακαλυφθεί από ακτινομύκητες, μερικές από τις οποίες χρησιμοποιούνται ήδη εμπορικά1,23. Επομένως, η ανάλυση των μεταβολιτών των ακτινομυκήτων για την απομόνωση φυσικών προϊόντων με επιθυμητές βιολογικές δράσεις θεωρείται αποτελεσματική στρατηγική. Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση, την κουμαμοναμίδη, από το S. werraensis και τη συνθέσαμε με επιτυχία. Το ουρσονικό οξύ είναι ένα συνθετικό ενδιάμεσο της ουρβεναμίδης και των παραγώγων της. Μπορεί να προκαλέσει χαρακτηριστικό στράβωμα των ριζών, να εμφανίσει μέτρια έως ισχυρή ζιζανιοκτόνο δράση και να βλάψει άμεσα ή έμμεσα τους μικροσωληνίσκους των φυτών. Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης του ουρμοτονικού οξέος μπορεί να διαφέρει από αυτόν των υπαρχόντων αναστολέων των μικροσωληνίσκων, καθώς το KAND 11 διαταράσσει επίσης τα νημάτια ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο, γεγονός που υποδηλώνει έναν ρυθμιστικό μηχανισμό μέσω του οποίου το ουρμοτονικό οξύ και τα παράγωγά του επηρεάζουν ένα ευρύ φάσμα κυτταροσκελετικών δομών.
Ο περαιτέρω λεπτομερής χαρακτηρισμός του ουρβενονικού οξέος θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης του. Συγκεκριμένα, ο επόμενος στόχος είναι η αξιολόγηση της ικανότητας του ουρσονικού οξέος να συνδέεται με αναγμένα μικροσωληνάρια, ώστε να προσδιοριστεί εάν το ουρσονικό οξύ και τα παράγωγά του δρουν άμεσα στους μικροσωληνίσκους και τους αποπολυμερίζουν ή εάν η δράση τους οδηγεί σε αποσταθεροποίηση των μικροσωληνίσκων. Επιπλέον, στην περίπτωση που οι μικροσωληνίσκοι δεν αποτελούν άμεσο στόχο, ο προσδιορισμός της θέσης δράσης και των μοριακών στόχων του ουρσονικού οξέος στα φυτικά κύτταρα θα βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση των ιδιοτήτων των σχετικών ενώσεων και των πιθανών τρόπων βελτίωσης της ζιζανιοκτόνου δράσης. Η δοκιμασία βιοδραστικότητας που διεξήγαμε αποκάλυψε τη μοναδική κυτταροτοξική ικανότητα του ουρσονικού οξέος στην ανάπτυξη φυτών όπως η Arabidopsis thaliana, ο καπνός και το ηπατικό βότανο, ενώ ούτε τα κύτταρα E. coli ούτε τα κύτταρα HeLa επηρεάστηκαν. Η μικρή ή καθόλου τοξικότητα στα ζωικά κύτταρα αποτελεί πλεονέκτημα των παραγώγων ουρσονικού οξέος εάν αναπτυχθούν ως ζιζανιοκτόνα για χρήση σε ανοιχτά γεωργικά χωράφια. Πράγματι, δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι είναι κοινές δομές στους ευκαρυώτες, η επιλεκτική αναστολή τους στα φυτά αποτελεί βασική απαίτηση για τα ζιζανιοκτόνα. Για παράδειγμα, η προπυζαμίδη, ένας παράγοντας αποπολυμερισμού μικροσωληνίσκων που συνδέεται άμεσα με την τουμπουλίνη και αναστέλλει τον πολυμερισμό, χρησιμοποιείται ως ζιζανιοκτόνο λόγω της χαμηλής τοξικότητάς της στα ζωικά κύτταρα24. Σε αντίθεση με τη δισοπυραμίδη, τα σχετικά βενζαμίδια έχουν διαφορετικές εξειδικεύσεις στόχου. Εκτός από τους φυτικούς μικροσωληνίσκους, το RH-4032 ή η βενζοξαμίδη αναστέλλει επίσης τους μικροσωληνίσκους ζωικών κυττάρων ή ωομυκήτων, αντίστοιχα, και η ζαλιλαμίδη χρησιμοποιείται ως μυκητοκτόνο λόγω της χαμηλής φυτοτοξικότητάς της25,26,27. Η πρόσφατα ανακαλυφθείσα αρκούδα και τα παράγωγά της εμφανίζουν επιλεκτική κυτταροτοξικότητα έναντι των φυτών, αλλά αξίζει να σημειωθεί ότι περαιτέρω τροποποιήσεις μπορεί να μεταβάλουν την εξειδίκευσή τους ως στόχου, παρέχοντας ενδεχομένως πρόσθετα παράγωγα για τον έλεγχο παθογόνων μυκήτων ή ωομυκήτων.
Οι μοναδικές ιδιότητες του ουρβενονικού οξέος και των παραγώγων του είναι χρήσιμες για την ανάπτυξή τους ως ζιζανιοκτόνα και τη χρήση τους ως ερευνητικά εργαλεία. Η σημασία του κυτταροσκελετού στον έλεγχο του σχήματος των φυτικών κυττάρων είναι ευρέως αναγνωρισμένη. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα φυτά έχουν αναπτύξει πολύπλοκους μηχανισμούς οργάνωσης των φλοιωδών μικροσωληνίσκων ελέγχοντας τη δυναμική των μικροσωληνίσκων για τον σωστό έλεγχο της μορφογένεσης. Έχει εντοπιστεί ένας μεγάλος αριθμός μορίων που είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση της δραστηριότητας των μικροσωληνίσκων και η σχετική έρευνα βρίσκεται ακόμη σε εξέλιξη3,4,28. Η τρέχουσα κατανόησή μας για τη δυναμική των μικροσωληνίσκων στα φυτικά κύτταρα δεν εξηγεί πλήρως τους μηχανισμούς οργάνωσης των φλοιωδών μικροσωληνίσκων. Για παράδειγμα, αν και τόσο η δισοπυραμίδη όσο και η ορυζαλίνη μπορούν να αποπολυμερίσουν τους μικροσωληνίσκους, η δισοπυραμίδη προκαλεί σοβαρή παραμόρφωση των ριζών, ενώ η ορυζαλίνη έχει σχετικά ήπια επίδραση. Επιπλέον, οι μεταλλάξεις στην τουμπουλίνη, η οποία σταθεροποιεί τους μικροσωληνίσκους, προκαλούν επίσης δεξιόστροφη περιστροφή στις ρίζες, ενώ η πακλιταξέλη, η οποία επίσης σταθεροποιεί τη δυναμική των μικροσωληνίσκων, δεν το κάνει. Επομένως, η μελέτη και ο εντοπισμός των μοριακών στόχων του ουρσολικού οξέος θα πρέπει να παρέχει νέες γνώσεις σχετικά με τη ρύθμιση των φλοιωδών μικροσωληνίσκων των φυτών. Ομοίως, μελλοντικές συγκρίσεις χημικών ουσιών που είναι αποτελεσματικές στην προώθηση της παραμορφωμένης ανάπτυξης, όπως η δισοπυραμίδη, και λιγότερο αποτελεσματικών χημικών ουσιών, όπως η ορυζαλίνη ή το κουμαμοτορικό οξύ, θα παράσχουν ενδείξεις για το πώς συμβαίνει η παραμορφωμένη ανάπτυξη.
Από την άλλη πλευρά, οι αναδιατάξεις του κυτταροσκελετού που σχετίζονται με την άμυνα αποτελούν μια άλλη πιθανότητα για να εξηγηθεί η κυτταροτοξικότητα του ουρσονικού οξέος. Η μόλυνση ενός παθογόνου ή η εισαγωγή ενός διεγέρτη σε φυτικά κύτταρα προκαλεί μερικές φορές καταστροφή του κυτταροσκελετού και επακόλουθο κυτταρικό θάνατο29. Για παράδειγμα, έχει αναφερθεί ότι η κρυπτοξανθίνη που προέρχεται από ωομύκητες διαταράσσει τους μικροσωληνίσκους και τα νημάτια ακτίνης πριν από τον κυτταρικό θάνατο του καπνού, παρόμοια με αυτό που συμβαίνει με τη θεραπεία KAND30,31. Οι ομοιότητες μεταξύ των αμυντικών αποκρίσεων και των κυτταρικών αποκρίσεων που προκαλούνται από το ουρσονικό οξύ μας οδήγησαν στην υπόθεση ότι ενεργοποιούν κοινές κυτταρικές διεργασίες, αν και είναι εμφανής μια ταχύτερη και ισχυρότερη επίδραση του ουρσονικού οξέος από την κρυπτοξανθίνη. Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι η διαταραχή των νηματίων ακτίνης προάγει τον αυθόρμητο κυτταρικό θάνατο, ο οποίος δεν συνοδεύεται πάντα από διαταραχή των μικροσωληνίσκων29. Επιπλέον, μένει να δούμε εάν είτε το παθογόνο είτε ο διεγέρτης προκαλεί παραμορφωμένη ανάπτυξη ριζών, όπως κάνουν τα παράγωγα του ουρσονικού οξέος. Έτσι, η μοριακή γνώση που συνδέει τις αμυντικές αποκρίσεις και τον κυτταροσκελετό είναι ένα ελκυστικό πρόβλημα που πρέπει να αντιμετωπιστεί. Αξιοποιώντας την παρουσία ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους που σχετίζονται με το ουρσονικό οξύ, καθώς και μια σειρά παραγώγων με ποικίλες δραστικότητες, μπορούν να παρέχουν ευκαιρίες για τη στόχευση άγνωστων κυτταρικών μηχανισμών.
Συνολικά, η ανακάλυψη και η εφαρμογή νέων ενώσεων που τροποποιούν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων θα παράσχει ισχυρές μεθόδους για την αντιμετώπιση των σύνθετων μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον προσδιορισμό του σχήματος των φυτικών κυττάρων. Σε αυτό το πλαίσιο, η πρόσφατα αναπτυγμένη ένωση ουρμοτονικό οξύ, η οποία επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους και τα νημάτια ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο, μπορεί να δώσει την ευκαιρία να αποκρυπτογραφήσουμε τη σύνδεση μεταξύ του ελέγχου των μικροσωληνίσκων και αυτών των άλλων μηχανισμών. Έτσι, η χημική και βιολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας ουρβενονικό οξύ θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τους μοριακούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν τον κυτταροσκελετό των φυτών.
Εμβολιάστε το S. werraensis MK493-CF1 σε μια φιάλη Erlenmeyer των 500 mL με διάφραγμα που περιέχει 110 mL μέσου σποράς που αποτελείται από 2% (w/v) γαλακτόζη, 2% (w/v) πάστα Essence, 1% (w/v) σύνθεση Bacto. -σόγια (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) εκχύλισμα καλαμποκιού (KOGOSTCH Co., Ltd., Ιαπωνία), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 και 0,2% CaCO3 σε απιονισμένο νερό. (pH 7,4 πριν από την αποστείρωση). Οι καλλιέργειες σποράς επωάστηκαν σε περιστροφικό αναδευτήρα (180 rpm) στους 27°C για 2 ημέρες. Καλλιέργεια παραγωγής μέσω ζύμωσης στερεάς κατάστασης. Η καλλιέργεια σπόρων (7 ml) μεταφέρθηκε σε φιάλη K-1 των 500 ml που περιείχε 40 g μέσου παραγωγής που αποτελούνταν από 15 g συμπιεσμένου κριθαριού (MUSO Co., Ltd., Ιαπωνία) και 25 g απιονισμένου νερού (το pH δεν ρυθμίστηκε πριν από την αποστείρωση). Η ζύμωση πραγματοποιήθηκε στους 30°C στο σκοτάδι για 14 ημέρες. Το υλικό ζύμωσης εκχυλίστηκε με 40 ml/φιάλη EtOH και φυγοκεντρήθηκε (1500 g, 4°C, 10 λεπτά). Το υπερκείμενο της καλλιέργειας (60 ml) εκχυλίστηκε με ένα μείγμα 10% MeOH/EtOAc. Η οργανική στιβάδα εξατμίστηκε υπό μειωμένη πίεση για να ληφθεί ένα υπόλειμμα (59,5 mg), το οποίο υποβλήθηκε σε HPLC με έκλουση με βαθμιδωτή έκλουση (0–10 λεπτά: 90%) σε στήλη αντίστροφης φάσης (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × μήκος 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 λεπτά: 90% H2O/CH3CN έως 70% H2O/CH3CN (βαθμιδωτή έκλουση), 35–45 λεπτά: 90% H2O/EtOH, 45–155 λεπτά: 90% H2O/EtOH έως 100% EtOH (βαθμιδωτή έκλουση (βαθμιδωτή έκλουση), 155–200 λεπτά: 100% EtOH) με ρυθμό ροής 1,5 ml/min, απομονώθηκε κουμαμοναμίδη (1, 36,0 mg) ως λευκή άμορφη σκόνη.
Κουμαμοτοαμίδιο(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H). ), 4,08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ υπολογισμένη τιμή: 141,0659, μετρούμενη τιμή: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Οι σπόροι Columbia (Col-0) ελήφθησαν από το Κέντρο Βιολογικών Πόρων Arabidopsis (ABRC) με άδεια για ερευνητική χρήση. Οι σπόροι Col-0 πολλαπλασιάστηκαν και διατηρήθηκαν υπό τις εργαστηριακές μας συνθήκες και χρησιμοποιήθηκαν ως φυτά Arabidopsis άγριου τύπου. Οι σπόροι Arabidopsis αποστειρώθηκαν επιφανειακά και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Murashige και Skoog μισής περιεκτικότητας που περιείχε 2% σακχαρόζη (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-μορφολινο)αιθανοσουλφονικό οξύ (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) και 1,5% άγαρ (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, στους 23 °C και σταθερό φως. Οι σπόροι του μεταλλαγμένου phs1-1 παρείχαν ο T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology).
Οι σπόροι του στελέχους SR-1 παρέχονταν από τον T. Hashimoto (Ινστιτούτο Επιστήμης και Τεχνολογίας της Νάρα) και χρησιμοποιήθηκαν ως φυτά καπνού άγριου τύπου. Οι σπόροι καπνού αποστειρώθηκαν επιφανειακά και εμποτίστηκαν σε αποστειρωμένο νερό για τρεις νύχτες για την προώθηση της βλάστησης, στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα μισής περιεκτικότητας που περιείχε 2% σακχαρόζη, 0,05% (w/v) MES και 0,8% κόμμι τζελάνης (Fujifilm Wako Pure Chemical) (Murashige. και Skoog medium) με pH 5,7 και επωάστηκαν στους 23°C υπό συνεχές φως.
Το στέλεχος Tak-1 παρείχε ο T. Kohchi (Πανεπιστήμιο του Κιότο) και χρησιμοποιήθηκε ως η πρότυπη πειραματική μονάδα για τη μελέτη του ηπατικού βότανου. Το Gemma ελήφθη από αποστειρωμένα καλλιεργημένα φυτά και στη συνέχεια τοποθετήθηκε σε καλλιεργητικό μέσο Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) που περιείχε 1% σακχαρόζη και 0,3% κόμμι τζελάνης και επωάστηκε στους 23°C υπό συνεχές φως.
Τα κύτταρα καπνού BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) παρέχονταν από τον S. Hasezawa (Πανεπιστήμιο του Τόκιο). Τα κύτταρα BY-2 αραιώθηκαν 95 φορές σε τροποποιημένο μέσο Linsmeier και Skoog και συμπληρώθηκαν εβδομαδιαίως με 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ 32. Το κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκε σε περιστροφικό αναδευτήρα στις 130 στροφές/λεπτό στους 27°C στο σκοτάδι. Πλύνετε τα κύτταρα με 10 φορές τον όγκο του φρέσκου μέσου και επαναιωρήστε τα στο ίδιο μέσο. Οι διαγονιδιακές κυτταρικές σειρές BY-2 που εκφράζουν σταθερά τον δείκτη μικροσωληνίσκων TagRFP-TUA6 ή τον δείκτη νηματίου ακτίνης GFP-ABD2 κάτω από τον υποκινητή 35S του ιού της μωσαϊκής του κουνουπιδιού δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται33,34,35. Αυτές οι κυτταρικές σειρές μπορούν να διατηρηθούν και να συγχρονιστούν χρησιμοποιώντας διαδικασίες παρόμοιες με αυτές που χρησιμοποιήθηκαν για την αρχική κυτταρική σειρά BY-2.
Τα κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle κατά Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό ορό βοοειδών, 1,2 U/ml πενικιλίνη και 1,2 μg/ml στρεπτομυκίνη σε επωαστήρα 37°C με 5% CO2.
Όλα τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους ιαπωνικούς κανονισμούς και τις οδηγίες βιοασφάλειας.
Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO· Fujifilm Wako Pure Chemical) ως διαλύματα παρακαταθήκης και αραιώθηκαν σε μέσο MS για Arabidopsis και καπνό ή σε μέσο Gamborg B5 για ηπατικό βότανο. Για τη δοκιμασία αναστολής ανάπτυξης ριζών, περισσότεροι από 10 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε τις υποδεικνυόμενες ενώσεις ή DMSO. Οι σπόροι επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης για 7 ημέρες. Τα σπορόφυτα φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκε το μήκος των ριζών. Για τη δοκιμασία βλάστησης Arabidopsis, 48 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε 200 μM ένωση ή DMSO. Οι σπόροι Arabidopsis αναπτύχθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης και ο αριθμός των βλαστάνοντων σπορόφυτων μετρήθηκε 7 ημέρες μετά τη βλάστηση (dag). Για τη δοκιμασία βλάστησης καπνού, 24 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε 200 μM KAND ή DMSO. Οι σπόροι καπνού αναπτύχθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης και ο αριθμός των βλαστάνοντων σπορόφυτων μετρήθηκε μετά από 14 ημέρες. Για τη δοκιμασία αναστολής ανάπτυξης ηπατικού μοσχεύματος, 9 έμβρυα από κάθε πλάκα τοποθετήθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND ή DMSO και επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης για 14 ημέρες.
Χρησιμοποιήστε σπορόφυτα χρωματισμένα με 5 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (PI) για να απεικονίσετε την οργάνωση του μεριστώματος της ρίζας. Τα σήματα PI παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ TCS SPE (Leica Microsystems).
Η ιστοχημική χρώση των ριζών με β-γλυκουρονιδάση (GUS) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Malami και Benfey36. Τα σπορόφυτα σταθεροποιήθηκαν σε ακετόνη 90% όλη τη νύχτα, χρωματίστηκαν με 0,5 mg/ml 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-β-d-γλυκουρονικό οξύ σε ρυθμιστικό διάλυμα GUS για 1 ώρα και τοποθετήθηκαν σε διάλυμα ένυδρης χλωραλδεΰδης (8 g ένυδρης χλωράλης, 2 ml νερού και 1 ml γλυκερόλης) και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία διαφορικής αντίθεσης παρεμβολής χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Οι γωνίες ρίζας μετρήθηκαν σε σπορόφυτα 7 ημερών που αναπτύχθηκαν σε κατακόρυφα τοποθετημένα τρυβλία. Μετρήστε τη γωνία της ρίζας από την κατεύθυνση του διανύσματος βαρύτητας όπως περιγράφεται στο βήμα 6.
Η διάταξη των φλοιωδών μικροσωληνίσκων παρατηρήθηκε όπως περιγράφεται, με μικρές τροποποιήσεις στο πρωτόκολλο 37. Το αντίσωμα κατά της β-τουμπουλίνης (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) και η αντι-IgG ποντικού συζευγμένη με Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή και δευτερογενή αντισώματα σε αραιώσεις 1:1000 και 1:100, αντίστοιχα. Οι εικόνες φθορισμού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο σάρωσης ομοεστιακού λέιζερ TCS SPE (Leica Microsystems). Λήψη εικόνων Z-stack και δημιουργία προβολών μέγιστης έντασης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων HeLa πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το Cell Counting Kit 8 (Dojindo) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Η ανάπτυξη του E. coli DH5α αναλύθηκε μετρώντας την κυτταρική πυκνότητα σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο στα 600 nm (OD600).
Η κυτταροσκελετική οργάνωση σε διαγονιδιακά κύτταρα BY-2 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με μια συσκευή ομοεστιακής σάρωσης CSU-X1 (Yokogawa) και μια κάμερα sCMOS (Zyla, Andor Technology). Η κυτταροσκελετική πυκνότητα αξιολογήθηκε με ανάλυση εικόνας, η οποία ποσοτικοποίησε το ποσοστό των κυτταροσκελετικών pixel μεταξύ των κυτταροπλασματικών pixel σε ομοεστιακές εικόνες χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ όπως περιγράφεται38,39.
Για την ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα BY-2, ένα κλάσμα του κυτταρικού εναιωρήματος επωάστηκε με 0,05% μπλε Evans για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Η επιλεκτική χρώση των νεκρών κυττάρων με μπλε Evans εξαρτάται από την εξώθηση της χρωστικής από τα βιώσιμα κύτταρα μέσω της άθικτης πλασματικής μεμβράνης40. Τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (BX53, Olympus).
Τα κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS σε υγροποιημένο επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μM KAND 11, κουμαμοναμικό οξύ 6, κουμαμοναμίδη 1, 100 ng/ml κολσεμίδη (Gibco) ή 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) για 6 ώρες στους 37°C. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με MetOH για 10 λεπτά και στη συνέχεια με οξικό άλας για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα σταθεροποιημένα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα β-τουμπουλίνης (1D4A4, Proteintech: 66240-1) αραιωμένο σε 0,5% BSA/PBS για 2 ώρες, πλύθηκαν 3 φορές με TBST και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας Alexa Fluor. 488 για 1 ώρα. – IgG ποντικού (Thermo Fisher Scientific: A11001) και 15 ng/ml 4′,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) αραιωμένο σε 0,5% BSA/PBS. Μετά από πλύση με TBST τρεις φορές, τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon Eclipse Ti-E. Οι εικόνες λήφθηκαν με ψυχόμενη κάμερα Hamamatsu ORCA-R2 CCD χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph (Molecular Devices).
Ώρα δημοσίευσης: 17 Ιουνίου 2024