Σας ευχαριστούμε που επισκεφτήκατε το Nature.com.Η έκδοση του προγράμματος περιήγησης που χρησιμοποιείτε έχει περιορισμένη υποστήριξη CSS.Για καλύτερα αποτελέσματα, συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε μια νεότερη έκδοση του προγράμματος περιήγησής σας (ή να απενεργοποιήσετε τη λειτουργία συμβατότητας στον Internet Explorer).Στο μεταξύ, για να διασφαλίσουμε τη συνεχή υποστήριξη, εμφανίζουμε τον ιστότοπο χωρίς στυλ ή JavaScript.
Η ανακάλυψη και η ευεργετική χρήση φυσικών προϊόντων μπορεί να συμβάλει στη βελτίωση της ανθρώπινης ζωής.Οι χημικές ουσίες που αναστέλλουν την ανάπτυξη των φυτών χρησιμοποιούνται ευρέως ως ζιζανιοκτόνα για τον έλεγχο των ζιζανίων.Λόγω της ανάγκης χρήσης διαφορετικών τύπων ζιζανιοκτόνων, υπάρχει ανάγκη εντοπισμού ενώσεων με νέους μηχανισμούς δράσης.Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση Ν-αλκοξυπυρρόλης, το κουμαμοναμίδιο, από το Streptomyces werraensis MK493-CF1 και καθιερώσαμε την πλήρη διαδικασία σύνθεσης.Μέσω δοκιμών βιολογικής δραστηριότητας, ανακαλύψαμε ότι το urs-μονοαμικό οξύ είναι ένα συνθετικό ενδιάμεσο του urs-μονοαμιδίου και ένα δυναμικόαναστολέας της ανάπτυξης των φυτών.Επιπλέον, έχουμε αναπτύξει διάφορα παράγωγα ουρβενονικού οξέος, συμπεριλαμβανομένου του παραγώγου ουρβενυλοξυ (UDA), το οποίο έχει υψηλή ζιζανιοκτόνο δράση χωρίς να επηρεάζει αρνητικά την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa.Βρήκαμε επίσης ότι τα παράγωγα ουρμοτονικού οξέος διαταράσσουν τους μικροσωληνίσκους των φυτών.Επιπλέον, το KAND επηρεάζει τα νήματα της ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο.Αυτές οι πολύπλευρες επιδράσεις διαφέρουν από εκείνες των γνωστών αναστολέων μικροσωληνίσκων και υποδηλώνουν έναν νέο μηχανισμό δράσης για το ουρσονικό οξύ, το οποίο αντιπροσωπεύει ένα σημαντικό πλεονέκτημα στην ανάπτυξη νέων ζιζανιοκτόνων.
Η ανακάλυψη και η πρακτική εφαρμογή ωφέλιμων φυσικών προϊόντων και των παραγώγων τους είναι ένα μέσο για τη βελτίωση της ποιότητας της ανθρώπινης ζωής.Οι δευτερογενείς μεταβολίτες που παράγονται από μικροοργανισμούς, φυτά και έντομα έχουν οδηγήσει σε σημαντικές προόδους στην ιατρική και τη γεωργία.Πολλά αντιβιοτικά και φάρμακα κατά της λευχαιμίας έχουν αναπτυχθεί από φυσικά προϊόντα.Επιπλέον, διάφοροι τύποιΦυτοφάρμακα, μυκητοκτόνα και ζιζανιοκτόνα εξάγονται από αυτά τα φυσικά προϊόντα για χρήση στη γεωργία.Συγκεκριμένα, τα ζιζανιοκτόνα καταπολέμησης των ζιζανίων είναι σημαντικά εργαλεία για την αύξηση της απόδοσης των καλλιεργειών στη σύγχρονη γεωργία και ήδη χρησιμοποιούνται στο εμπόριο διάφοροι τύποι ενώσεων.Αρκετές κυτταρικές διεργασίες στα φυτά, όπως η φωτοσύνθεση, ο μεταβολισμός των αμινοξέων, η σύνθεση κυτταρικού τοιχώματος, η ρύθμιση της μίτωσης, η σηματοδότηση φυτοορμονών ή η πρωτεϊνική σύνθεση, θεωρούνται τυπικοί στόχοι των ζιζανιοκτόνων.Οι ενώσεις που αναστέλλουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων είναι μια κοινή κατηγορία ζιζανιοκτόνων που επηρεάζουν την ανάπτυξη των φυτών επηρεάζοντας τη μιτωτική ρύθμιση2.
Οι μικροσωληνίσκοι είναι συστατικά του κυτταροσκελετού και διατηρούνται ευρέως στα ευκαρυωτικά κύτταρα.Το ετεροδιμερές τουμπουλίνης αποτελείται από γραμμικά πρωτονήματα μικροσωληνίσκων που σχηματίζουν α-τουμπουλίνη και β-τουμπουλίνη, με 13 πρωτονήματα να σχηματίζουν μια κυλινδρική δομή.Οι μικροσωληνίσκοι παίζουν πολλαπλούς ρόλους στα φυτικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένου του προσδιορισμού του σχήματος των κυττάρων, της κυτταρικής διαίρεσης και της ενδοκυτταρικής μεταφοράς3,4.Τα φυτικά κύτταρα περιέχουν μικροσωληνίσκους κάτω από την πλασματική μεμβράνη μεσοφάσης και αυτοί οι λεγόμενοι μικροσωληνίσκοι του φλοιού πιστεύεται ότι ελέγχουν την οργάνωση των μικροϊνιδίων κυτταρίνης μέσω της ρύθμισης των συμπλεγμάτων συνθάσης κυτταρίνης4,5.Οι φλοιώδεις μικροσωληνίσκοι των επιδερμικών κυττάρων της ρίζας, που υπάρχουν στη ζώνη ταχείας επιμήκυνσης του άκρου της ρίζας, βρίσκονται πλευρικά και οι μικροΐνες κυτταρίνης ακολουθούν αυτούς τους μικροσωληνίσκους και περιορίζουν την κατεύθυνση της κυτταρικής επέκτασης, προάγοντας έτσι την ανισότροπη επιμήκυνση των κυττάρων.Επομένως, η λειτουργία των μικροσωληνίσκων σχετίζεται στενά με τη μορφολογία των φυτών.Οι υποκαταστάσεις αμινοξέων σε γονίδια που κωδικοποιούν την τουμπουλίνη προκαλούν λοξή συστοιχία μικροσωληνίσκων του φλοιού και ανάπτυξη στην αριστερή ή δεξιά πλευρά στο Arabidopsis 6,7.Ομοίως, μεταλλάξεις σε πρωτεΐνες που σχετίζονται με μικροσωληνίσκους που ρυθμίζουν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων μπορούν επίσης να οδηγήσουν σε παραμορφωμένη ανάπτυξη ριζών8,9,10,11,12,13.Επιπλέον, η θεραπεία με ζιζανιοκτόνα που διαταράσσουν τους μικροσωληνίσκους, όπως το δισοπυραμίδιο, επίσης γνωστό ως pretilachlor, προκαλεί επίσης λοξή ανάπτυξη της ρίζας στην αριστερή πλευρά14.Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι η ακριβής ρύθμιση της λειτουργίας των μικροσωληνίσκων είναι κρίσιμη για τον προσδιορισμό της κατεύθυνσης ανάπτυξης των φυτών.
Έχουν ανακαλυφθεί διάφοροι τύποι αναστολέων μικροσωληνίσκων και αυτά τα φάρμακα έχουν συνεισφέρει σημαντικά στην κυτταροσκελετική έρευνα, καθώς και στη γεωργία και την ιατρική2.Ειδικότερα, η ορυζαλίνη, οι ενώσεις δινιτροανιλίνης, το δισοπυραμίδιο, οι ενώσεις που σχετίζονται με το βενζαμίδιο και τα ανάλογα τους μπορούν να αναστείλουν τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων και ως εκ τούτου να αναστείλουν την ανάπτυξη των φυτών.Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται ευρέως ως ζιζανιοκτόνα.Ωστόσο, δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι είναι ένα σημαντικό συστατικό των φυτικών και ζωικών κυττάρων, οι περισσότεροι αναστολείς μικροσωληνίσκων είναι κυτταροτοξικοί και για τους δύο τύπους κυττάρων.Ως εκ τούτου, παρά την αναγνωρισμένη χρησιμότητά τους ως ζιζανιοκτόνα, ένας περιορισμένος αριθμός παραγόντων κατά των μικροσωληνίσκων χρησιμοποιείται για πρακτικούς σκοπούς.
Το Streptomyces είναι ένα γένος της οικογένειας Streptomyces, το οποίο περιλαμβάνει αερόβια, θετικά κατά Gram, νηματώδη βακτήρια και είναι ευρέως γνωστό για την ικανότητά του να παράγει ένα ευρύ φάσμα δευτερογενών μεταβολιτών.Ως εκ τούτου, θεωρείται μια από τις σημαντικότερες πηγές νέων βιολογικά ενεργών φυσικών προϊόντων.Στην τρέχουσα μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση που ονομάζεται κουμαμοναμίδη, η οποία απομονώθηκε από Streptomyces werraensis MK493-CF1 και S. werraensis ISP 5486. Χρησιμοποιώντας φασματική ανάλυση και πλήρη φασματική ανάλυση, η δομή της κουμαμοναμίδης χαρακτηρίστηκε και ο μοναδικός σκελετός Ν-αλκοξυπυρρόλης καθορίστηκε.σύνθεση.Το ουρσμονικό οξύ, ένα συνθετικό ενδιάμεσο της ουρσμονοαμίδης και των παραγώγων της, βρέθηκε ότι αναστέλλει την ανάπτυξη και τη βλάστηση του δημοφιλούς μοντέλου φυτού Arabidopsis thaliana.Σε μια μελέτη σχέσης δομής-δραστικότητας, βρήκαμε ότι μια ένωση με C9 τροποποιημένη σε ουρσονικό οξύ, που ονομάζεται εννευλοξυ παράγωγο του ουρσονικού οξέος (KAND), ενισχύει σημαντικά την ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη και τη βλάστηση.Συγκεκριμένα, ο αναστολέας της ανάπτυξης των φυτών που ανακαλύφθηκε πρόσφατα επηρέασε επίσης την ανάπτυξη του καπνού και του ήπατος και δεν ήταν κυτταροτοξικός για τα βακτήρια ή τα κύτταρα HeLa.Επιπλέον, ορισμένα παράγωγα ουρμοτονικού οξέος επάγουν έναν παραμορφωμένο φαινότυπο ρίζας, υπονοώντας ότι αυτά τα παράγωγα επηρεάζουν άμεσα ή έμμεσα τους μικροσωληνίσκους.Σύμφωνα με αυτή την ιδέα, οι παρατηρήσεις μας για μικροσωληνίσκους που έχουν επισημανθεί είτε ανοσοϊστοχημικά είτε με φθορίζουσες πρωτεΐνες υποδεικνύουν ότι η επεξεργασία KAND αποπολυμερίζει τους μικροσωληνίσκους.Επιπλέον, η θεραπεία με παράγωγα κουμαμοτονικού οξέος διέκοψε τα μικρονήματα ακτίνης.Έτσι, ανακαλύψαμε έναν νέο αναστολέα ανάπτυξης φυτών του οποίου ο μοναδικός μηχανισμός δράσης περιλαμβάνει την καταστροφή του κυτταροσκελετού.
Το στέλεχος MK493-CF1 απομονώθηκε από το έδαφος στο Shinagawa-ku, Τόκιο.Το στέλεχος MK493-CF1 σχημάτισε καλά διακλαδισμένο στρωματικό μυκήλιο.Προσδιορίστηκε η μερική αλληλουχία του 16S ριβοσωμικού RNA γονιδίου (1422 bp).Αυτό το στέλεχος είναι πολύ παρόμοιο με το S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, Τ: τυπικό στέλεχος, 99,93%).Με βάση αυτό το αποτέλεσμα, προσδιορίστηκε ότι αυτό το στέλεχος σχετίζεται στενά με το στέλεχος τύπου S. werraensis.Επομένως, ονομάσαμε προσωρινά αυτό το στέλεχος S. werraensis MK493-CF1.Το S. werraensis ISP 5486T παράγει επίσης τις ίδιες βιοδραστικές ενώσεις.Δεδομένου ότι υπήρξε μικρή πρώιμη έρευνα για τη λήψη φυσικών προϊόντων από αυτόν τον μικροοργανισμό, διεξήχθη περαιτέρω χημική έρευνα.Μετά την καλλιέργεια του S. werraensis MK493-CF1 σε μέσο κριθαριού με ζύμωση σε στερεά κατάσταση στους 30°C για 14 ημέρες, το μέσο εκχυλίστηκε με 50% EtOH.60 ml δείγματος ξηράνθηκαν για να ληφθούν 59,5 mg ακατέργαστου εκχυλίσματος.Το ακατέργαστο εκχύλισμα υποβλήθηκε σε HPLC ανάστροφης φάσης για να δώσει Ν-μεθοξυ-1Η-πυρρολ-2-καρβοξαμίδιο (1, που ονομάζεται κουμαμοναμίδιο, 36,0 mg).Η συνολική ποσότητα του 1 είναι περίπου το 60% του ακατέργαστου εκχυλίσματος.Ως εκ τούτου, αποφασίσαμε να μελετήσουμε λεπτομερώς τις ιδιότητες της κουμαμοτοαμίδης 1.
Το κουμαμοναμίδιο 1 είναι μια λευκή άμορφη σκόνη και η φασματομετρία μάζας υψηλής ανάλυσης (HRESIMS) επιβεβαιώνει το C6H8N2O2 (Εικ. 1).Το C2-υποκατεστημένο θραύσμα πυρρολίου αυτής της ένωσης χαρακτηρίζεται από δΗ 6,94 (1Η, t, J = 2,8, 4,8 Hz, Η-4), δΗ 6,78 (1Η, d, J = 2,5, δΗ σε φάσμα 1Η NMR: 4,5 Hz , Η-5) και δΗ 6,78 (1Η, d, J = 2,5 Ηζ, Η-6), και το φάσμα 13C NMR δείχνει την παρουσία τεσσάρων ατόμων άνθρακα sp2.Η παρουσία μιας αμιδικής ομάδας στη θέση C2 εκτιμήθηκε με συσχέτιση HMBC από το πρωτόνιο C-3 προς τον αμιδικό καρβονυλ άνθρακα στο δC 161.1.Επιπλέον, κορυφές 1Η και 13 C NMR σε δΗ 4,10 (3Η, S) και δC 68,3 υποδεικνύουν την παρουσία Ν-μεθοξυ ομάδων στο μόριο.Αν και η σωστή θέση της μεθόξυ ομάδας δεν είχε ακόμη προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας φασματοσκοπική ανάλυση, όπως φασματοσκοπία ενισχυμένης διαφοράς και συντομογραφία πυρηνικού Overhauser (NOEDF), το Ν-μεθοξυ-1Η-πυρρολ-2-καρβοξαμίδιο έγινε η πρώτη υποψήφια ένωση.
Για να προσδιοριστεί η σωστή δομή του 1, πραγματοποιήθηκε μια συνολική σύνθεση (Εικ. 2α).Η επεξεργασία της εμπορικά διαθέσιμης 2-αμινοπυριδίνης 2 με m-CPBA είχε ως αποτέλεσμα το αντίστοιχο Ν-οξείδιο 3 σε ποσοτική απόδοση.Μετά την 2-αμινοαζίδωση του 2, η αντίδραση κυκλοσυμπύκνωσης που περιγράφεται από τον Abramovich διεξήχθη σε βενζόλιο στους 90°C για να ληφθεί το επιθυμητό 1-υδροξυ-1Η-πυρρολο-2-καρβονιτρίλιο 5 σε γραμμάρια.Ταχύτητα 60% (δύο στάδια).15,16.Η μεθυλίωση και η υδρόλυση του 4 έδωσε στη συνέχεια 1-μεθοξυ-1Η-πυρρολο-2-καρβοξυλικό οξύ (που ονομάζεται «κουμοτονικό οξύ», 6) σε καλή απόδοση (70%, δύο στάδια).Τέλος, η αμίδωση μέσω του ενδιάμεσου χλωριδίου οξέος 6 χρησιμοποιώντας υδατική αμμωνία έδωσε το αμίδιο Kumamoto 1 σε απόδοση 98%.Όλα τα φασματικά δεδομένα του συντιθέμενου 1 ήταν παρόμοια με του απομονωμένου 1, επομένως προσδιορίστηκε η δομή του 1.
Γενική σύνθεση και ανάλυση της βιολογικής δραστηριότητας ουρβεναμίδης και ουρβενικού οξέος.(α) Ολική σύνθεση αμιδίου Kumamoto.(β) Σπορόφυτα άγριου τύπου Arabidopsis Columbia (Col) ηλικίας επτά ημερών αναπτύχθηκαν σε πλάκες Murashige και Skoog (MS) που περιείχαν κουμαμοναμίδη 6 ή κουμαμοναμίδη 1 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις.Μπάρα κλίμακας = 1 cm.
Αρχικά, αξιολογήσαμε τις βιολογικές δραστηριότητες του ουρβεναμίδης και των ενδιάμεσών του για την ικανότητά τους να ρυθμίζουν την ανάπτυξη των φυτών.Προσθέσαμε διάφορες συγκεντρώσεις ουρσμοναμίδης 1 ή ουρσμονικού οξέος 6 στο μέσο άγαρ MS και καλλιεργήσαμε σπορόφυτα Arabidopsis thaliana σε αυτό το μέσο.Αυτές οι δοκιμασίες έδειξαν ότι οι υψηλές συγκεντρώσεις (500 μΜ) του 6 ανέστειλαν την ανάπτυξη των ριζών (Εικ. 2β).Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε διάφορα παράγωγα αντικαθιστώντας τη θέση N1 του 6 και πραγματοποιήσαμε μελέτες σχέσης δομής-δραστηριότητας σε αυτά (η διαδικασία αναλογικής σύνθεσης περιγράφεται στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες (SI)).Τα σπορόφυτα Arabidopsis αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιείχε 50 μΜ παράγωγα ουρσονικού οξέος και μετρήθηκε το μήκος της ρίζας.όπως φαίνεται στην εικόνα.Όπως φαίνεται στα Σχήματα 3a, b και S1, τα κουμαμοοξέα έχουν διαφορετικά μήκη γραμμικών αλκοξυ αλυσίδων (9, 10, 11, 12 και 13) ή μεγάλες αλκοξυ αλυσίδες (15, 16 και 17) στη θέση Ν1.Τα παράγωγα έδειξαν σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των ριζών.Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η εφαρμογή 200 μM 10, 11 ή 17 ανέστειλε τη βλάστηση (Εικ. 3c και S2).
Μελέτη της σχέσης δομής-δραστικότητας αμιδίου Kumamoto και σχετικών ενώσεων.(α) Σχήμα δομής και σύνθεσης αναλόγων.(β) Ποσοτικοποίηση του μήκους της ρίζας δενδρυλλίων ηλικίας 7 ημερών που αναπτύσσονται σε μέσο MS με ή χωρίς παράγωγα κουμαμοναμίδης 50 μM.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (τεστ t, σελ< 0,05).n>18. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SD.nt σημαίνει "δεν έχει δοκιμαστεί" επειδή περισσότερο από το 50% των σπόρων δεν βλάστησαν.(γ) Ποσοτικοποίηση του ρυθμού βλάστησης των επεξεργασμένων σπόρων που επωάστηκαν για 7 ημέρες σε μέσο MS με ή χωρίς 200 μM κουμαμοναμίδη και σχετικές ενώσεις.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (τεστ chi-square).n=96.
Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη πλευρικών αλυσίδων αλκυλίου μακρύτερες από το C9 μείωσε την ανασταλτική δράση, υποδηλώνοντας ότι οι ενώσεις που σχετίζονται με το κουμαμοτοϊκό οξύ απαιτούν πλευρικές αλυσίδες συγκεκριμένου μεγέθους για να επιδείξουν τη βιολογική τους δράση.
Επειδή η ανάλυση σχέσης δομής-δραστικότητας έδειξε ότι το C9 τροποποιήθηκε σε ουρσονικό οξύ και το εννευλοξυ παράγωγο του ουρσονικού οξέος (στο εξής θα αναφέρεται ως KAND 11) ήταν ο πιο αποτελεσματικός αναστολέας ανάπτυξης φυτών, πραγματοποιήσαμε έναν πιο λεπτομερή χαρακτηρισμό του KAND 11. Θεραπεία του Arabidopsis με 50 μΜ KAND 11 απέτρεψαν σχεδόν πλήρως τη βλάστηση, ενώ χαμηλότερες συγκεντρώσεις (40, 30, 20 ή 10 μΜ) του KAND 11 ανέστειλαν την ανάπτυξη των ριζών με τρόπο δοσοεξαρτώμενο (Εικ. 4α, β).Για να ελέγξουμε εάν το KAND 11 επηρεάζει τη βιωσιμότητα του μεριστώματος της ρίζας, εξετάσαμε μεριστώματα ρίζας που χρωματίστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο (PI) και μετρήσαμε το μέγεθος της επιφάνειας του μεριστώματος.Το μέγεθος του μεριστώματος των δενδρυλλίων που αναπτύχθηκε σε ένα μέσο που περιείχε 25 μM KAND-11 ήταν 151,1 ± 32,5 μm, ενώ το μέγεθος του μεριστώματος των φυταρίων που αναπτύχθηκαν σε μέσο ελέγχου που περιείχε DMSO ήταν 264,7 ± 30,8 μm (Εικ. 4c, d) , το οποίο υποδεικνύει ότι το KAND-11 αποκαθιστά την κυτταρική δραστηριότητα.διάδοση.Μερίστημα ρίζας.Σύμφωνα με αυτό, η θεραπεία KAND 11 μείωσε την ποσότητα του σήματος δείκτη κυτταρικής διαίρεσης CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS στο ριζικό μερίστωμα (Εικ. 4e) 17 .Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το KAND 11 αναστέλλει την ανάπτυξη των ριζών μειώνοντας τη δραστηριότητα πολλαπλασιασμού των κυττάρων.
Ανάλυση της ανασταλτικής επίδρασης των παραγώγων ουρβενονικού οξέος (ουρβενυλοξυ παράγωγα) στην ανάπτυξη.(α) Σπορόφυτα άγριου τύπου Col 7 ημερών που αναπτύσσονται σε πλάκες MS με τις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND 11. Κλίμακα = 1 cm.(β) Ποσοτικοποίηση του μήκους της ρίζας.Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (Tukey HSD test, σελ< 0,05).n>16. Τα δεδομένα εμφανίζονται ως μέσος όρος ± SD.(γ) Ομοεστιακή μικροσκοπία ριζών άγριου τύπου Col που έχουν χρωματιστεί με ιωδιούχο προπίδιο που αναπτύσσονται σε πλάκες MS με ή χωρίς 25 μM KAND 11. Οι λευκές αγκύλες υποδεικνύουν μερίστωμα ρίζας.Μπάρα κλίμακας = 100 μm.(δ) Ποσοτικοποίηση του μεγέθους του μεριστώματος της ρίζας (n = 10 έως 11).Οι στατιστικές διαφορές προσδιορίστηκαν με τη χρήση t-test (σελ< 0,05).Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το μέσο μέγεθος μεριστώματος.(ε) Μικροσκοπία αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) ενός ριζικού μεριστώματος που περιέχει το κατασκεύασμα CDKB2.1pro: CDKB2;1-GUS χρωματίστηκε και χρωματίστηκε σε σπορόφυτα ηλικίας 5 ημερών που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με ή χωρίς ανάλυση KAND 25 μΜ.
Η φυτοτοξικότητα του KAND 11 δοκιμάστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας ένα άλλο δικοτυλήδονο φυτό, τον καπνό (Nicotiana tabacum) και έναν σημαντικό οργανισμό χερσαίου μοντέλου φυτού, το συκώτι (Marchantia polymorpha).Όπως και στην περίπτωση του Arabidopsis, τα σπορόφυτα καπνού SR-1 που αναπτύχθηκαν σε μέσο που περιέχει 25 μM KAND 11 παρήγαγαν μικρότερες ρίζες (Εικ. 5α).Επιπλέον, 40 από τους 48 σπόρους φύτρωσαν σε πλάκες που περιείχαν 200 μM KAND 11, ενώ και οι 48 σπόροι φύτρωσαν σε ψευδοκατεργασμένα μέσα, υποδεικνύοντας ότι οι υψηλότερες συγκεντρώσεις KAND ήταν σημαντικές (σ.< 0,05;Τεστ chi -τετράγωνο) ανέστειλε τη βλάστηση του καπνού.(Εικ. 5β).Επιπλέον, η συγκέντρωση του KAND 11 που ανέστειλε την ανάπτυξη βακτηρίων στο ήπαρ ήταν παρόμοια με την αποτελεσματική συγκέντρωση στο Arabidopsis (Εικ. 5γ).Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το KAND 11 μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη μιας ποικιλίας φυτών.Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανή κυτταροτοξικότητα ενώσεων που σχετίζονται με το μονοαμίδιο της αρκούδας σε άλλους οργανισμούς, δηλαδή ανθρώπινα κύτταρα HeLa και στέλεχος Escherichia coli DH5α, ως εκπρόσωποι ανώτερων ζωικών και βακτηριακών κυττάρων, αντίστοιχα.Σε μια σειρά αναλύσεων πολλαπλασιασμού κυττάρων, παρατηρήσαμε ότι το κουμαμοναμίδιο 1, το κουμαμοναμιδικό οξύ 6 και το KAND 11 δεν επηρέασαν την ανάπτυξη των κυττάρων HeLa ή E. coli σε συγκεντρώσεις 100 μΜ (Εικ. 5d, e).
Αναστολή ανάπτυξης του KAND 11 σε μη-Arabidopsis οργανισμούς.(α) Σπορόφυτα καπνού SR-1 άγριου τύπου ηλικίας δύο εβδομάδων αναπτύχθηκαν σε κάθετα τοποθετημένες πλάκες MS που περιείχαν 25 μM KAND 11. (β) Σπορόφυτα καπνού άγριου τύπου SR-1 ηλικίας δύο εβδομάδων αναπτύχθηκαν σε οριζόντια Πλάκες MS που περιέχουν 200 μM KAND 11. (γ) Μπουμπούκια ήπατος Tak-1 άγριου τύπου δύο εβδομάδων που αναπτύχθηκαν σε πλάκες Gamborg B5 με τις ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND 11. Τα κόκκινα βέλη υποδεικνύουν σπόρια που σταμάτησαν να αναπτύσσονται εντός της επώασης των δύο εβδομάδων περίοδος.(δ) Δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού κυττάρων HeLa.Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε σε σταθερά χρονικά διαστήματα χρησιμοποιώντας ένα κιτ μέτρησης κυττάρων 8 (Dojindo).Ως έλεγχος, τα κύτταρα HeLa υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 5 μg/ml ακτινομυκίνη D (Act D), η οποία αναστέλλει τη μεταγραφή της RNA πολυμεράσης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο.Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.(ε) Δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων Ε. coli.Η ανάπτυξη E. coli αναλύθηκε με μέτρηση OD600.Ως έλεγχος, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 50 μg/ml αμπικιλλίνη (Amp), η οποία αναστέλλει τη σύνθεση βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος.Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.
Για να αποκρυπτογραφήσουμε τον μηχανισμό δράσης της κυτταροτοξικότητας που προκαλείται από ενώσεις που σχετίζονται με το ουραμίδιο, αναλύσαμε εκ νέου τα παράγωγα ουρβενικού οξέος με μέτρια ανασταλτική δράση.όπως φαίνεται στην εικόνα.Όπως φαίνεται στα Σχήματα 2β, 6α, τα σπορόφυτα που αναπτύχθηκαν σε πλάκες άγαρ που περιείχαν υψηλές συγκεντρώσεις (200 μΜ) ουρμοτονικού οξέος 6 παρήγαγαν βραχύτερες και αριστερές καμπύλες ρίζες (θ = – 23,7 ± 6,1), ενώ από φυτάρια που αναπτύχθηκαν στο μέσο ελέγχου, το σπορόφυτα παρήγαγαν σχεδόν ευθείες ρίζες (θ = – 3,8 ± 7,1).Αυτή η χαρακτηριστική λοξή ανάπτυξη είναι γνωστό ότι προκύπτει από δυσλειτουργία των μικροσωληνίσκων του φλοιού14,18.Σύμφωνα με αυτό το εύρημα, τα φάρμακα που αποσταθεροποιούν τους μικροσωληνίσκους δισοπυραμίδη και οριζαλίνη προκάλεσαν παρόμοια κλίση της ρίζας υπό τις συνθήκες ανάπτυξής μας (Εικ. 2b, 6a).Ταυτόχρονα, δοκιμάσαμε παράγωγα ουρμοτονικού οξέος και επιλέξαμε αρκετά από αυτά που, σε ορισμένες συγκεντρώσεις, προκάλεσαν λοξή ανάπτυξη της ρίζας.Οι ενώσεις 8, 9 και 15 άλλαξαν την κατεύθυνση ανάπτυξης της ρίζας στα 75 μΜ, 50 μΜ και 40 μΜ, αντίστοιχα, υποδεικνύοντας ότι αυτές οι ενώσεις μπορούν να αποσταθεροποιήσουν αποτελεσματικά τους μικροσωληνίσκους (Εικ. 2b, 6a).Δοκιμάσαμε επίσης το πιο ισχυρό παράγωγο ουρσολικού οξέος, το KAND 11, σε χαμηλότερη συγκέντρωση (15 μΜ) και διαπιστώσαμε ότι η εφαρμογή του KAND 11 ανέστειλε την ανάπτυξη των ριζών και ότι η κατεύθυνση της ανάπτυξης της ρίζας ήταν ανομοιόμορφη, αν και έτειναν να έχουν κλίση προς τα αριστερά ( Εικόνα Γ3)..Επειδή οι υψηλότερες συγκεντρώσεις φαρμάκων αποσταθεροποίησης μικροσωληνίσκων μερικές φορές αναστέλλουν την ανάπτυξη των φυτών αντί να προκαλούν κλίση της ρίζας, στη συνέχεια αξιολογήσαμε την πιθανότητα ότι το KAND 11 επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους παρατηρώντας τους μικροσωληνίσκους του φλοιού στα επιδερμικά κύτταρα της ρίζας.Η ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας αντισώματα κατά της β-τουμπουλίνης σε επιδερμικά κύτταρα ριζών δενδρυλλίων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 25 μM KAND 11 έδειξε την εξαφάνιση σχεδόν όλων των μικροσωληνίσκων του φλοιού στα επιδερμικά κύτταρα στη ζώνη επιμήκυνσης (Εικ. 6β).Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το κουμαμοτονικό οξύ και τα παράγωγά του δρουν άμεσα ή έμμεσα στους μικροσωληνίσκους για να τους διασπάσουν και ότι αυτές οι ενώσεις είναι νέοι αναστολείς μικροσωληνίσκων.
Το ουρσονικό οξύ και τα παράγωγά του μεταβάλλουν τους φλοιώδεις μικροσωληνίσκους στο Arabidopsis thaliana.α) Γωνία κλίσης ρίζας μετρούμενη παρουσία διαφόρων παραγώγων ουρμοτονικού οξέος στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις.Αναλύθηκαν επίσης τα αποτελέσματα δύο ενώσεων που είναι γνωστό ότι αναστέλλουν τους μικροσωληνίσκους: τη δισοπυραμίδη και την οριζαλίνη.Το ένθετο δείχνει το πρότυπο που χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της γωνίας ανάπτυξης της ρίζας.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (τεστ t, σελ< 0,05).n>19. Μπάρα ζυγαριάς = 1 cm.(β) Φλοιικοί μικροσωληνίσκοι σε επιδερμικά κύτταρα στη ζώνη επιμήκυνσης.Μικροσωληνίσκοι σε ρίζες Arabidopsis Col άγριου τύπου που αναπτύχθηκαν σε πλάκες MS με ή χωρίς 25 μM KAND 11 οπτικοποιήθηκαν με ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιώντας πρωτογενή αντισώματα β-τουμπουλίνης και δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με Alexa Fluor.Γραμμή κλίμακας = 10 μm.(γ) Μιτωτική δομή μικροσωληνίσκων στο μερίστωμα της ρίζας.Οι μικροσωληνίσκοι οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημική χρώση.Οι μιτωτικές δομές, συμπεριλαμβανομένων των ζωνών πρόφασης, των ατράκτων και των φραγκμοπλαστών, μετρήθηκαν από ομοεστιακές εικόνες.Τα βέλη υποδεικνύουν μιτωτικές δομές μικροσωληνίσκων.Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές με την εικονική θεραπεία (τεστ t, σελ< 0,05).n>9. Ράβδος κλίμακας = 50 μm.
Αν και το Ursa έχει την ικανότητα να διαταράσσει τη λειτουργία των μικροσωληνίσκων, ο μηχανισμός δράσης του αναμένεται να είναι διαφορετικός από τους τυπικούς παράγοντες αποπολυμερισμού μικροσωληνίσκων.Για παράδειγμα, υψηλότερες συγκεντρώσεις παραγόντων αποπολυμερισμού μικροσωληνίσκων όπως η δισοπυραμίδη και η οριζαλίνη προκαλούν ανισότροπη επέκταση των επιδερμικών κυττάρων, ενώ το KAND 11 όχι.Επιπλέον, η ταυτόχρονη εφαρμογή του KAND 11 και της δισοπυραμίδης οδήγησε σε συνδυασμένη απόκριση ανάπτυξης ρίζας που προκαλείται από δισοπυραμίδιο και παρατηρήθηκε αναστολή ανάπτυξης που προκαλείται από KAND 11 (Εικ. S4).Αναλύσαμε επίσης την απόκριση του υπερευαίσθητου μεταλλαγμένου δισοπυραμιδίου 1-1 (phs1-1) στο KAND 11. Το phs1-1 έχει μια μη κανονική μετάλλαξη σημείου κινάσης τουμπουλίνης και παράγει μικρότερες ρίζες όταν υποβάλλεται σε επεξεργασία με δισοπυραμίδιο9,20.Τα μεταλλαγμένα σπορόφυτα phs1-1 που αναπτύχθηκαν σε μέσο άγαρ που περιέχει KAND 11 είχαν μικρότερες ρίζες παρόμοιες με αυτές που αναπτύχθηκαν σε δισοπυραμίδιο (εικ. S5).
Επιπλέον, παρατηρήσαμε μιτωτικές δομές μικροσωληνίσκων, όπως ζώνες πρόφασης, ατράκτους και φραγκμοπλάστες, στο μερίστωμα της ρίζας των δενδρυλλίων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KAND 11. Σε συμφωνία με τις παρατηρήσεις για CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, μια σημαντική μείωση παρατηρήθηκε ο αριθμός των μιτωτικών μικροσωληνίσκων (Εικ. .6c).
Για να χαρακτηρίσουμε την κυτταροτοξικότητα του KAND 11 σε υποκυτταρική ανάλυση, επεξεργαστήκαμε κύτταρα αιωρήματος BY-2 καπνού με KAND 11 και παρατηρήσαμε την απόκρισή τους.Προσθέσαμε πρώτα KAND 11 σε κύτταρα BY-2 που εκφράζουν TagRFP-TUA6, το οποίο επισημαίνει με φθορισμό μικροσωληνίσκους, για να αξιολογήσουμε την επίδραση του KAND 11 στους μικροσωληνίσκους του φλοιού.Η πυκνότητα των μικροσωληνίσκων του φλοιού αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας, η οποία ποσοτικοποίησε το ποσοστό των κυτταροσκελετικών εικονοστοιχείων μεταξύ των κυτταροπλασματικών εικονοστοιχείων.Τα αποτελέσματα της ανάλυσης έδειξαν ότι μετά από θεραπεία με 50 μΜ ή 100 μΜ KAND 11 για 1 ώρα, η πυκνότητα μειώθηκε σημαντικά σε 0,94 ± 0,74% ή 0,23 ± 0,28%, αντίστοιχα, ενώ η πυκνότητα των κυττάρων που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO , ανήλθε σε 1,634 % (Εικ. 7α).Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν με την παρατήρηση στο Arabidopsis ότι η θεραπεία με KAND 11 προκαλεί αποπολυμερισμό των μικροσωληνίσκων του φλοιού (Εικ. 6β).Εξετάσαμε επίσης τη γραμμή BY-2 με νημάτια ακτίνης σημασμένα με GFP-ABD μετά από θεραπεία με την ίδια συγκέντρωση KAND 11 και παρατηρήσαμε ότι η θεραπεία με KAND 11 διέκοψε τα νημάτια ακτίνης.Η θεραπεία με 50 μM ή 100 μΜ KAND 11 για 1 ώρα μείωσε σημαντικά την πυκνότητα του νήματος ακτίνης στο 1,20 ± 0,62% ή 0,61 ± 0,26%, αντίστοιχα, ενώ η πυκνότητα στα κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με DMSO ήταν 1,69 ± 0,52% (Εικ. 0,51%).7β).Αυτά τα αποτελέσματα έρχονται σε αντίθεση με τα αποτελέσματα της προπυζαμίδης, η οποία δεν επηρεάζει τα νήματα της ακτίνης, και της λατρουνκουλίνης Β, ενός αποπολυμεριστή ακτίνης που δεν επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους (Σχήμα SI S6).Επιπλέον, η θεραπεία με κουμαμοναμίδη 1, κουμαμοναμιδικό οξύ 6 ή KAND 11 δεν επηρέασε τους μικροσωληνίσκους στα κύτταρα HeLa (SI Εικόνα S7).Έτσι, ο μηχανισμός δράσης του KAND 11 πιστεύεται ότι είναι διαφορετικός από αυτόν των γνωστών διαταρακτών του κυτταροσκελετού.Επιπλέον, η μικροσκοπική μας παρατήρηση των κυττάρων BY-2 που υποβλήθηκαν σε αγωγή με KAND 11 αποκάλυψε την έναρξη κυτταρικού θανάτου κατά τη διάρκεια της θεραπείας με KAND 11 και έδειξε ότι η αναλογία των νεκρών κυττάρων με μπλε χρωματισμό Evans δεν αυξήθηκε σημαντικά μετά από 30 λεπτά θεραπείας με KAND 11, ενώ μετά από 90 λεπτά θεραπείας με 50 μM ή 100 μΜ KAND, ο αριθμός των νεκρών κυττάρων αυξήθηκε σε 43,7% ή 80,1%, αντίστοιχα (Εικ. 7γ).Συνολικά, αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το νέο παράγωγο ουρσολικού οξέος KAND 11 είναι ένας ειδικός για φυτό κυτταροσκελετικός αναστολέας με έναν προηγουμένως άγνωστο μηχανισμό δράσης.
Το KAND επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους του φλοιού, τα νημάτια ακτίνης και τη βιωσιμότητα των κυττάρων BY-2 του καπνού.(α) Οπτικοποίηση μικροσωληνίσκων του φλοιού σε κύτταρα BY-2 παρουσία TagRFP-TUA6.Τα κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KAND 11 (50 μΜ ή 100 μΜ) ή DMSO εξετάστηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία.Η πυκνότητα των μικροσωληνίσκων του φλοιού υπολογίστηκε από μικρογραφίες 25 ανεξάρτητων κυττάρων.Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (Tukey HSD test, σελ< 0,05).Γραμμή κλίμακας = 10 μm.(β) Νήματα φλοιώδους ακτίνης σε κύτταρα BY-2 που οπτικοποιήθηκαν παρουσία GFP-ABD2.Τα κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KAND 11 (50 μΜ ή 100 μΜ) ή DMSO εξετάστηκαν με ομοεστιακή μικροσκοπία.Η πυκνότητα των νημάτων της φλοιώδους ακτίνης υπολογίστηκε από μικρογραφίες 25 ανεξάρτητων κυττάρων.Τα γράμματα υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές (Tukey HSD test, σελ< 0,05).Γραμμή κλίμακας = 10 μm.(γ) Παρατήρηση νεκρών κυττάρων BY-2 με χρώση Evans blue.Κύτταρα BY-2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με KAND 11 (50 μΜ ή 100 μΜ) ή DMSO εξετάστηκαν με μικροσκοπία φωτεινού πεδίου.n=3.Μπάρα κλίμακας = 100 μm.
Η ανακάλυψη και η εφαρμογή νέων φυσικών προϊόντων έχει οδηγήσει σε σημαντικές προόδους σε διάφορες πτυχές της ανθρώπινης ζωής, συμπεριλαμβανομένης της ιατρικής και της γεωργίας.Έχει πραγματοποιηθεί ιστορική έρευνα για τη λήψη χρήσιμων ενώσεων από φυσικούς πόρους.Συγκεκριμένα, οι ακτινομύκητες είναι γνωστό ότι είναι χρήσιμοι ως αντιπαρασιτικά αντιβιοτικά για νηματώδεις λόγω της ικανότητάς τους να παράγουν διάφορους δευτερογενείς μεταβολίτες όπως η αβερμεκτίνη, η κύρια ένωση της ιβερμεκτίνης και της μπλεομυκίνης και τα παράγωγά της, που χρησιμοποιούνται ιατρικά ως αντικαρκινικός παράγοντας21,22.Ομοίως, μια ποικιλία ζιζανιοκτόνων ενώσεων έχει ανακαλυφθεί από ακτινομύκητες, μερικές από τις οποίες χρησιμοποιούνται ήδη εμπορικά1,23.Ως εκ τούτου, η ανάλυση των μεταβολιτών των ακτινομυκήτων για την απομόνωση φυσικών προϊόντων με επιθυμητές βιολογικές δραστηριότητες θεωρείται μια αποτελεσματική στρατηγική.Σε αυτή τη μελέτη, ανακαλύψαμε μια νέα ένωση, το κουμαμοναμίδιο, από το S. werraensis και το συνθέσαμε με επιτυχία.Το ουρσονικό οξύ είναι ένα συνθετικό ενδιάμεσο του ουρβεναμιδίου και των παραγώγων του.Μπορεί να προκαλέσει χαρακτηριστικό κατσάρωμα της ρίζας, να παρουσιάζει μέτρια έως ισχυρή ζιζανιοκτόνο δράση και να βλάψει άμεσα ή έμμεσα τους μικροσωληνίσκους των φυτών.Ωστόσο, ο μηχανισμός δράσης του ουρμοτονικού οξέος μπορεί να διαφέρει από αυτόν των υπαρχόντων αναστολέων μικροσωληνίσκων, καθώς το KAND 11 διαταράσσει επίσης τα νήματα ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο, υποδηλώνοντας έναν ρυθμιστικό μηχανισμό με τον οποίο το ουρμοτονικό οξύ και τα παράγωγά του επηρεάζουν ένα ευρύ φάσμα κυτταροσκελετικών δομών..
Περαιτέρω λεπτομερής χαρακτηρισμός του ουρβενονικού οξέος θα βοηθήσει στην καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης του ουρβενονικού οξέος.Συγκεκριμένα, ο επόμενος στόχος είναι να αξιολογηθεί η ικανότητα του ουρσονικού οξέος να δεσμεύεται σε ανηγμένους μικροσωληνίσκους για να προσδιοριστεί εάν το ουρσονικό οξύ και τα παράγωγά του δρουν απευθείας στους μικροσωληνίσκους και τους αποπολυμερίζουν ή εάν η δράση τους οδηγεί σε αποσταθεροποίηση μικροσωληνίσκων.Επιπλέον, στην περίπτωση που οι μικροσωληνίσκοι δεν είναι άμεσος στόχος, η αναγνώριση της θέσης δράσης και των μοριακών στόχων του ουρσονικού οξέος στα φυτικά κύτταρα θα βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση των ιδιοτήτων των σχετικών ενώσεων και πιθανών τρόπων βελτίωσης της ζιζανιοκτόνου δράσης.Η ανάλυση βιοδραστικότητας μας αποκάλυψε τη μοναδική κυτταροτοξική ικανότητα του ουρσονικού οξέος στην ανάπτυξη φυτών όπως το Arabidopsis thaliana, ο καπνός και το ήπαρ, ενώ δεν επηρεάστηκαν ούτε τα κύτταρα E. coli ούτε τα κύτταρα HeLa.Η μικρή ή καθόλου τοξικότητα στα ζωικά κύτταρα είναι ένα πλεονέκτημα των παραγώγων ουρσονικού οξέος εάν αναπτύσσονται ως ζιζανιοκτόνα για χρήση σε ανοιχτούς αγρούς.Πράγματι, δεδομένου ότι οι μικροσωληνίσκοι είναι κοινές δομές στα ευκαρυωτικά, η επιλεκτική αναστολή τους στα φυτά είναι βασική απαίτηση για τα ζιζανιοκτόνα.Για παράδειγμα, το προπυζαμίδιο, ένας παράγοντας αποπολυμερισμού μικροσωληνίσκων που συνδέεται άμεσα με την τουμπουλίνη και αναστέλλει τον πολυμερισμό, χρησιμοποιείται ως ζιζανιοκτόνο λόγω της χαμηλής τοξικότητάς του στα ζωικά κύτταρα24.Σε αντίθεση με το δισοπυραμίδιο, τα σχετικά βενζαμίδια έχουν διαφορετικές ειδικότητες στόχου.Εκτός από τους μικροσωληνίσκους φυτών, το RH-4032 ή το βενζοξαμίδιο αναστέλλει επίσης μικροσωληνίσκους ζωικών κυττάρων ή ωομυκήτων, αντίστοιχα, και η ζαλιλαμίδη χρησιμοποιείται ως μυκητοκτόνο λόγω της χαμηλής φυτοτοξικότητάς της25,26,27.Η πρόσφατα ανακαλυφθείσα αρκούδα και τα παράγωγά της εμφανίζουν εκλεκτική κυτταροτοξικότητα έναντι των φυτών, αλλά αξίζει να σημειωθεί ότι περαιτέρω τροποποιήσεις μπορεί να αλλάξουν την εξειδίκευση του στόχου τους, παρέχοντας πιθανώς πρόσθετα παράγωγα για τον έλεγχο παθογόνων μυκήτων ή ωομυκήτων.
Οι μοναδικές ιδιότητες του ουρβενονικού οξέος και των παραγώγων του είναι χρήσιμες για την ανάπτυξή τους ως ζιζανιοκτόνα και για χρήση ως ερευνητικά εργαλεία.Η σημασία του κυτταροσκελετού στον έλεγχο του σχήματος των φυτικών κυττάρων είναι ευρέως αναγνωρισμένη.Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα φυτά έχουν εξελίξει πολύπλοκους μηχανισμούς οργάνωσης των μικροσωληνίσκων του φλοιού ελέγχοντας τη δυναμική των μικροσωληνίσκων για τον σωστό έλεγχο της μορφογένεσης.Έχει εντοπιστεί μεγάλος αριθμός μορίων που είναι υπεύθυνα για τη ρύθμιση της δραστηριότητας των μικροσωληνίσκων και η σχετική έρευνα είναι ακόμη σε εξέλιξη3,4,28.Η τρέχουσα κατανόησή μας για τη δυναμική των μικροσωληνίσκων στα φυτικά κύτταρα δεν εξηγεί πλήρως τους μηχανισμούς οργάνωσης των μικροσωληνίσκων του φλοιού.Για παράδειγμα, αν και τόσο το δισοπυραμίδιο όσο και η ορυζαλίνη μπορούν να αποπολυμερίσουν τους μικροσωληνίσκους, η δισοπυραμίδη προκαλεί σοβαρή παραμόρφωση της ρίζας ενώ η ορυζαλίνη έχει σχετικά ήπιο αποτέλεσμα.Επιπλέον, οι μεταλλάξεις στη τουμπουλίνη, η οποία σταθεροποιεί τους μικροσωληνίσκους, προκαλούν επίσης δεξτροστροφή στις ρίζες, ενώ η πακλιταξέλη, η οποία σταθεροποιεί επίσης τη δυναμική των μικροσωληνίσκων, δεν το κάνει.Ως εκ τούτου, η μελέτη και ο προσδιορισμός των μοριακών στόχων του ουρσολικού οξέος θα πρέπει να παρέχει νέες γνώσεις για τη ρύθμιση των μικροσωληνίσκων του φλοιού των φυτών.Ομοίως, μελλοντικές συγκρίσεις χημικών ουσιών που είναι αποτελεσματικές στην προώθηση της παραμορφωμένης ανάπτυξης, όπως το δισοπυραμίδιο, και λιγότερο αποτελεσματικών χημικών ουσιών, όπως η οριζαλίνη ή το κουμαμοτορικό οξύ, θα παρέχουν ενδείξεις για το πώς συμβαίνει η παραμορφωμένη ανάπτυξη.
Από την άλλη πλευρά, οι σχετιζόμενες με την άμυνα κυτταροσκελετικές ανακατατάξεις είναι μια άλλη δυνατότητα για να εξηγηθεί η κυτταροτοξικότητα του ουρσονικού οξέος.Η μόλυνση ενός παθογόνου ή η εισαγωγή ενός διεγέρτη στα φυτικά κύτταρα μερικές φορές προκαλεί καταστροφή του κυτταροσκελετού και επακόλουθο κυτταρικό θάνατο29.Για παράδειγμα, η κρυπτοξανθίνη που προέρχεται από ωομύκητες έχει αναφερθεί ότι διαταράσσει τους μικροσωληνίσκους και τα νήματα της ακτίνης πριν από τον θάνατο των κυττάρων του καπνού, παρόμοια με αυτό που συμβαίνει με τη θεραπεία με KAND30,31.Οι ομοιότητες μεταξύ των αμυντικών αποκρίσεων και των κυτταρικών αποκρίσεων που προκαλούνται από το ουρσονικό οξύ μας οδήγησαν να υποθέσουμε ότι προκαλούν κοινές κυτταρικές διεργασίες, αν και είναι εμφανής μια ταχύτερη και ισχυρότερη επίδραση του ουρσονικού οξέος από την κρυπτοξανθίνη.Ωστόσο, μελέτες έχουν δείξει ότι η διάσπαση των νημάτων ακτίνης προάγει τον αυθόρμητο κυτταρικό θάνατο, ο οποίος δεν συνοδεύεται πάντα από διάσπαση των μικροσωληνίσκων29.Επιπλέον, μένει να φανεί εάν είτε το παθογόνο είτε ο διεγέρτης προκαλεί παραμορφωμένη ανάπτυξη της ρίζας, όπως κάνουν τα παράγωγα του ουρσονικού οξέος.Έτσι, η μοριακή γνώση που συνδέει τις αμυντικές αποκρίσεις και τον κυτταροσκελετό είναι ένα ελκυστικό πρόβλημα που πρέπει να αντιμετωπιστεί.Εκμεταλλευόμενοι την παρουσία ενώσεων χαμηλού μοριακού βάρους που σχετίζονται με το ουρσονικό οξύ, καθώς και μιας σειράς παραγώγων με διαφορετική ισχύ, μπορούν να παρέχουν ευκαιρίες στόχευσης άγνωστων κυτταρικών μηχανισμών.
Συνολικά, η ανακάλυψη και η εφαρμογή νέων ενώσεων που ρυθμίζουν τη δυναμική των μικροσωληνίσκων θα παράσχει ισχυρές μεθόδους για την αντιμετώπιση των πολύπλοκων μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον προσδιορισμό του σχήματος των φυτικών κυττάρων.Σε αυτό το πλαίσιο, η πρόσφατα αναπτυγμένη ένωση ουρμοτονικό οξύ, η οποία επηρεάζει τους μικροσωληνίσκους και τα νήματα της ακτίνης και προκαλεί κυτταρικό θάνατο, μπορεί να παρέχει την ευκαιρία να αποκρυπτογραφηθεί η σύνδεση μεταξύ του ελέγχου μικροσωληνίσκων και αυτών των άλλων μηχανισμών.Έτσι, η χημική και βιολογική ανάλυση χρησιμοποιώντας ουρβενικό οξύ θα μας βοηθήσει να κατανοήσουμε τους μοριακούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς που ελέγχουν τον κυτταροσκελετό των φυτών.
Εμβολιάστε το S. werraensis MK493-CF1 σε φιάλη Erlenmeyer με διάφραγμα 500 mL που περιέχει 110 mL μέσου σπόρου που αποτελείται από 2% (w/v) γαλακτόζη, 2% (w/v) πάστα Essence, 1% (w/v) σύνθεση Bacto .-σόγια (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (β/ο) εκχύλισμα καλαμποκιού (KOGOSTCH Co., Ltd., Ιαπωνία), 0,2% (β/ο) (NH4)2SO4 και 0,2% CaCO3 σε απιονισμένο νερό.(pH 7,4 πριν την αποστείρωση).Οι καλλιέργειες σπόρων επωάστηκαν σε περιστροφικό αναδευτήρα (180 rpm) στους 27°C για 2 ημέρες.Καλλιέργεια παραγωγής μέσω ζύμωσης σε στερεά κατάσταση.Η καλλιέργεια σπόρων (7 ml) μεταφέρθηκε σε φιάλη K-1 των 500 ml που περιείχε 40 g μέσου παραγωγής που αποτελείται από 15 g συμπιεσμένου κριθαριού (MUSO Co., Ltd., Japan) και 25 g απιονισμένου νερού (μη ρυθμισμένο pH πριν από την αποστείρωση).).Η ζύμωση πραγματοποιήθηκε στους 30°C στο σκοτάδι για 14 ημέρες.Το υλικό της ζύμωσης εκχυλίστηκε με 40 ml/φιάλη EtOH και φυγοκεντρήθηκε (1500 g, 4°C, 10 λεπτά).Το υπερκείμενο της καλλιέργειας (60 ml) εκχυλίστηκε με ένα μίγμα 10% MeOH/EtOAc.Η οργανική στιβάδα εξατμίστηκε υπό μειωμένη πίεση για να ληφθεί ένα υπόλειμμα (59,5 mg), το οποίο υποβλήθηκε σε HPLC με βαθμιδωτή έκλουση (0–10 λεπτά: 90%) σε στήλη αντίστροφης φάσης (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × μήκος 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 λεπτά: 90% H2O/CH3CN έως 70% H2O/CH3CN (βαθμίδα), 35–45 λεπτά: 90% H2O/EtOH, 45–155 λεπτά: 90% H2O /EtOH έως 100% EtOH (βαθμίδα (βαθμίδα), 155-200 λεπτά: 100% EtOH) με ρυθμό ροής 1,5 ml/min, απομονώθηκε κουμαμοναμίδιο (1, 36,0 mg) ως λευκή άμορφη σκόνη.
Κουμαμοτοαμίδη (1);1H-NMR (500 ΜΗζ, CDCl3) δ 6,93 (t, J = 2,5 Ηζ, 1 Η), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Ηζ 1Η), 6,05 (t, J = 3,8 Ηζ, 1 Η).4.08 (s, 3Η);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ υπολογισμένη τιμή: 141,0659, τιμή μέτρησης: 141,0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 157 cm.
Οι σπόροι Columbia (Col-0) ελήφθησαν από το Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) με άδεια για ερευνητική χρήση.Οι σπόροι Col-0 πολλαπλασιάστηκαν και διατηρήθηκαν στις εργαστηριακές μας συνθήκες και χρησιμοποιήθηκαν ως φυτά άγριου τύπου Arabidopsis.Οι σπόροι Arabidopsis αποστειρώθηκαν επιφανειακά και καλλιεργήθηκαν σε μέσο Murashige και Skoog μισής ισχύος που περιείχε 2% σακχαρόζη (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-μορφολινο)αιθανοσουλφονικό οξύ (MES) ( Fujifilm Wako Pure C ).) και 1,5% άγαρ (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, στους 23 °C και σταθερό φως.Οι σπόροι του μεταλλάγματος phs1-1 δόθηκαν από τον Τ. Hashimoto (Ινστιτούτο Επιστήμης και Τεχνολογίας Nara).
Οι σπόροι του στελέχους SR-1 δόθηκαν από τον T. Hashimoto (Nara Institute of Science and Technology) και χρησιμοποιήθηκαν ως φυτά καπνού άγριου τύπου.Οι σπόροι καπνού αποστειρώθηκαν επιφανειακά και εμποτίστηκαν σε αποστειρωμένο νερό για τρεις νύχτες για να προωθηθεί η βλάστηση, στη συνέχεια τοποθετήθηκαν σε διάλυμα μισής ισχύος που περιείχε 2% σακχαρόζη, 0,05% (w/v) MES και 0,8% κόμμι gellan (Fujifilm Wako Pure Chemical) Μουρασίγκε.και μέσο Skoog) με ρΗ 5,7 και επωάστηκε στους 23°C υπό σταθερό φως.
Το στέλεχος Tak-1 παρασχέθηκε από τον T. Kohchi (Πανεπιστήμιο του Κιότο) και χρησιμοποιήθηκε ως η τυπική πειραματική μονάδα για τη μελέτη του ήπατος.Το Gemma ελήφθη από αποστειρωμένα καλλιεργημένα φυτά και στη συνέχεια απλώθηκε σε μέσο Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) που περιείχε 1% σακχαρόζη και 0,3% κόμμι τζελάν και επωάστηκε στους 23°C υπό συνεχές φως.
Τα κύτταρα BY-2 καπνού (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) παρασχέθηκαν από τον S. Hasezawa (Πανεπιστήμιο του Τόκιο).Τα κύτταρα BY-2 αραιώθηκαν 95 φορές σε τροποποιημένο μέσο Linsmeier και Skoog και συμπληρώθηκαν εβδομαδιαία με 2,4-διχλωροφαινοξυοξικό οξύ 32 .Το κυτταρικό εναιώρημα αναμίχθηκε σε περιστροφικό αναδευτήρα στις 130 rpm στους 27°C στο σκοτάδι.Πλύνετε τα κύτταρα με 10 φορές μεγαλύτερο όγκο από φρέσκο μέσο και επαναιωρήστε στο ίδιο μέσο.Διαγονιδιακές κυτταρικές σειρές BY-2 που εκφράζουν σταθερά τον δείκτη μικροσωληνίσκου TagRFP-TUA6 ή τον δείκτη νήματος ακτίνης GFP-ABD2 κάτω από τον προαγωγέα ιού μωσαϊκού κουνουπιδιού 35S δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται33,34,35.Αυτές οι κυτταρικές σειρές μπορούν να διατηρηθούν και να συγχρονιστούν χρησιμοποιώντας διαδικασίες παρόμοιες με αυτές που χρησιμοποιούνται για την αρχική κυτταρική σειρά BY-2.
Τα κύτταρα HeLa καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο Eagle's Dulbecco (DMEM) (Life Technologies) συμπληρωμένο με 10% βόειο εμβρυϊκό ορό, 1,2 U/ml πενικιλλίνη και 1,2 μg/ml στρεπτομυκίνη σε επωαστήρα 37°C με 5% CO2.
Όλα τα πειράματα που περιγράφονται σε αυτό το χειρόγραφο πραγματοποιήθηκαν σύμφωνα με τους ιαπωνικούς κανονισμούς και οδηγίες βιοασφάλειας.
Οι ενώσεις διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO, Fujifilm Wako Pure Chemical) ως μητρικά διαλύματα και αραιώθηκαν σε μέσο MS για Arabidopsis και καπνό ή μέσο Gamborg Β5 για το ήπαρ.Για τον προσδιορισμό αναστολής ανάπτυξης ριζών, περισσότεροι από 10 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε τις υποδεικνυόμενες ενώσεις ή DMSO.Οι σπόροι επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης για 7 ημέρες.Τα σπορόφυτα φωτογραφήθηκαν και μετρήθηκε το μήκος των ριζών.Για τη δοκιμασία βλάστησης Arabidopsis, 48 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε 200 μΜ ένωση ή DMSO.Οι σπόροι Arabidopsis αναπτύχθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης και ο αριθμός των βλαστημένων δενδρυλλίων μετρήθηκε 7 ημέρες μετά τη βλάστηση (dag).Για τον προσδιορισμό βλάστησης καπνού, 24 σπόροι ανά πλάκα σπάρθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε 200 μΜ KAND ή DMSO.Οι σπόροι καπνού αναπτύχθηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης και ο αριθμός των φυταρίων που βλάστησαν μετρήθηκε μετά από 14 ημέρες.Για τη δοκιμασία αναστολής ανάπτυξης του ήπατος, 9 έμβρυα από κάθε πλάκα επιστρώθηκαν σε μέσο άγαρ που περιείχε τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις KAND ή DMSO και επωάστηκαν σε θάλαμο ανάπτυξης για 14 ημέρες.
Χρησιμοποιήστε σπορόφυτα βαμμένα με 5 mg/ml ιωδιούχο προπίδιο (PI) για να οπτικοποιήσετε την οργάνωση του μεριστώματος της ρίζας.Τα σήματα PI παρατηρήθηκαν με μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιώντας ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ TCS SPE (Leica Microsystems).
Η ιστοχημική χρώση των ριζών με β-γλυκουρονιδάση (GUS) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο που περιγράφεται από τους Malami και Benfey36.Τα σπορόφυτα σταθεροποιήθηκαν σε ακετόνη 90% όλη τη νύχτα, χρωματίστηκαν με 0,5 mg/ml 5-βρωμο-4-χλωρο-3-ινδολυλ-β-d-γλυκουρονικό οξύ σε ρυθμιστικό διάλυμα GUS για 1 ώρα και τοποθετήθηκαν σε ένα ενυδατωμένο διάλυμα χλωραλδεΰδης.(8 g ένυδρη χλωράλη, 2 ml νερό και 1 ml γλυκερόλη) και παρατηρήθηκε με μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Οι γωνίες ρίζας μετρήθηκαν σε σπορόφυτα 7 ημερών που αναπτύχθηκαν σε κατακόρυφα τοποθετημένες πλάκες.Μετρήστε τη γωνία της ρίζας από την κατεύθυνση του διανύσματος βαρύτητας όπως περιγράφεται στο βήμα 6.
Η διάταξη των μικροσωληνίσκων του φλοιού παρατηρήθηκε όπως περιγράφεται, με μικρές τροποποιήσεις στο πρωτόκολλο 37 .Το αντίσωμα κατά της β-τουμπουλίνης (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) και το συζευγμένο με Alexa Fluor 488 IgG αντι-ποντικού (Thermo Fisher Scientific: A32723) χρησιμοποιήθηκαν ως πρωτογενή και δευτερεύοντα αντισώματα σε αραιώσεις 1:1000 και 1:100, αντίστοιχα.Οι εικόνες φθορισμού ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης λέιζερ TCS SPE (Leica Microsystems).Αποκτήστε εικόνες στοίβας Z και δημιουργήστε προβολές μέγιστης έντασης σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Η δοκιμασία πολλαπλασιασμού κυττάρων HeLa διεξήχθη χρησιμοποιώντας κιτ μέτρησης κυττάρων 8 (Dojindo) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.
Η ανάπτυξη του Ε. coli DH5a αναλύθηκε με μέτρηση της κυτταρικής πυκνότητας σε καλλιέργεια χρησιμοποιώντας φασματοφωτόμετρο στα 600 nm (OD600).
Η κυτταροσκελετική οργάνωση σε διαγονιδιακά κύτταρα BY-2 παρατηρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο φθορισμού εξοπλισμένο με μια συσκευή ομοεστιακής σάρωσης CSU-X1 (Yokogawa) και μια κάμερα sCMOS (Zyla, Andor Technology).Η κυτταροσκελετική πυκνότητα εκτιμήθηκε με ανάλυση εικόνας, η οποία ποσοτικοποίησε το ποσοστό των κυτταροσκελετικών εικονοστοιχείων μεταξύ των κυτταροπλασματικών εικονοστοιχείων σε ομοεστιακές εικόνες χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ όπως περιγράφεται38,39.
Για την ανίχνευση του κυτταρικού θανάτου σε κύτταρα ΒΥ-2, ένα κλάσμα του κυτταρικού εναιωρήματος επωάστηκε με 0,05% μπλε Evans για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Η εκλεκτική χρώση με μπλε Evans των νεκρών κυττάρων εξαρτάται από την εξώθηση της χρωστικής από βιώσιμα κύτταρα από την άθικτη πλασματική μεμβράνη40.Τα χρωματισμένα κύτταρα παρατηρήθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου (BX53, Olympus).
Τα κύτταρα HeLa αναπτύχθηκαν σε DMEM συμπληρωμένο με 10% FBS σε έναν υγροποιημένο επωαστήρα στους 37°C και 5% CO2.Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μM KAND 11, κουμαμοναμικό οξύ 6, κουμαμοναμίδη 1, 100 ng/ml κολκεμίδη (Gibco) ή 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) για 6 ώρες στους 37°C.Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με MetOH για 10 λεπτά και στη συνέχεια με οξικό για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου.Τα σταθεροποιημένα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα β-τουμπουλίνης (1D4A4, Proteintech: 66240-1) αραιωμένο σε 0,5% BSA/PBS για 2 ώρες, πλύθηκαν 3 φορές με TBST και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντίσωμα κατσίκας Alexa Fluor.488 1 ώρα.– IgG ποντικιού (Thermo Fisher Scientific: A11001) και 15 ng/ml 4′,6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) αραιωμένα σε 0,5% BSA/PBS.Μετά από πλύση με TBST τρεις φορές, παρατηρήθηκαν χρωματισμένα κύτταρα σε ανεστραμμένο μικροσκόπιο Nikon Eclipse Ti-E.Οι εικόνες καταγράφηκαν με μια ψυχρή κάμερα Hamamatsu ORCA-R2 CCD χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph (Molecular Devices).
Ώρα δημοσίευσης: Ιουν-17-2024